洪家康，李 鑫，王建禎

?

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中EGFRv Ⅲ表達(dá)及對預(yù)后的影響

洪家康，李 鑫，王建禎

【摘要】目的 探討表皮生長因子突變受體Ⅲ（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRv Ⅲ）在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GB）中表達(dá)，研究影響患者預(yù)后的因素。方法 收集2012-01至2013-12的98例GB患者，通過免疫組化染色觀察EGFRv Ⅲ在組織標(biāo)本中表達(dá)情況，以性別、年齡、腫瘤體積、生長部位及卡氏評分（Karnofsky Perfomance Scale，KPS）等臨床參數(shù)作為研究因素進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果（1）免疫組化結(jié)果顯示，EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)率在GB病理標(biāo)本和正常腦組織中分別為38.8％和0％。（2）單因素分析結(jié)果顯示：EGFRv Ⅲ陽性組與陰性組中年齡、KPS評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Χ2=7.018，P=0.008；Χ2=12.101，P=0.001）。（3）GB患者生存分析結(jié)果顯示：EGFRv Ⅲ陰性組與陽性組的中位生存時間分別為13個月（95％CI，8.99～17.01）和12個月（95％CI，9.81～14.18）；在生存時間大于12個月患者中，EGFRv Ⅲ陰性組和陽性組的中位總生存時間分別為22個月（95％CI，16.91～27.09）和16個月（95％CI，14.04～17.95）；≥60歲和＜60歲兩組，中位總生存時間分別為10個月（95％CI，6.73～13.27）和15個月（95％CI，11.90～18.10）。（4）Cox多因素分析KPS、EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)是影響預(yù)后的獨立相關(guān)因素。結(jié)論 EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)、年齡和KPS評分是影響GB患者預(yù)后的危險因素。

【關(guān)鍵詞】表皮生長因子突變受體Ⅲ；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；預(yù)后

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GB）是惡性程度最高的神經(jīng)上皮腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織將其分級為Ⅳ級?，F(xiàn)行GB的標(biāo)準(zhǔn)化治療方式主要包括手術(shù)、放療及化療等，但目前GB的治療效果并不理想，預(yù)后較差。EGFRv是在GB發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的眾多分子遺傳學(xué)改變之一［1］。EGFRv Ⅲ可以使腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，并提升腫瘤細(xì)胞的活力和增加其對放療和化療的抵抗力，在GB的發(fā)生和發(fā)展過程有著重要作用［2］。但是EGFRv Ⅲ對于GB預(yù)后的臨床意義尚未有定論，筆者將探討EGFRv Ⅲ表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系及其對GB臨床預(yù)后的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集武警某院神經(jīng)腫瘤外科2012-01 至2013-12所有進(jìn)行GB手術(shù)患者的資料，符合條件98例。同時收集正常腦組織標(biāo)本18例（正常腦組織標(biāo)本由顱內(nèi)減壓術(shù)獲得）。98例GB患者中男52例，女46例，年齡為39～78歲，平均（61.2±7.3）歲；正常腦組織的患者中男11例，女7例，年齡為25～73歲，平均（43.6±8.47）歲。所有組織標(biāo)本均經(jīng)由武警某院病理科診斷確認(rèn)，4％甲醛固定后由石蠟包埋保存。所有臨床標(biāo)本采集與使用及隨訪資料的獲得均由倫理委員會審核通過。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次手術(shù)；（2）術(shù)后均行標(biāo)準(zhǔn)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）復(fù)發(fā)GB患者；（2）術(shù)前已行放化療；（3）術(shù)前已發(fā)現(xiàn)患有其他重大疾病。

1.3隨訪資料說明 通過閱讀患者既往病歷資料獲得患者性別、年齡、腫瘤體積、生長部位及KPS評分（用于評估患者健康狀況）等臨床參數(shù)，通過電話或者郵件等隨訪方式獲得GB患者的隨訪資料。統(tǒng)計隨訪獲得90例GB患者的生存資料，通過EGFRv Ⅲ表達(dá)結(jié)果將其分為EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)組與EGFRv Ⅲ陰性表達(dá)組，8例GB患者因失聯(lián)導(dǎo)致資料丟失。隨訪起始時間為2013-12，截止時間為2015-12；至隨訪截止時間患者已因GB死亡為完全數(shù)據(jù)；仍存活在統(tǒng)計學(xué)上歸為截尾數(shù)據(jù)；隨訪過程中丟失的患者和因其他原因死亡的患者歸為截尾數(shù)據(jù)。得到隨訪資料的GB患者90例，隨訪率為91.8％。

1.4試劑 EGFRvⅢ兔抗人多克隆抗體（鎮(zhèn)江博研生物公司，產(chǎn)品編號BYk-2558R），免疫組化試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液試劑盒（武漢博世德生物公司），均在有效期內(nèi)使用。

1.5免疫組織化學(xué)方法 將4 μm石蠟切片脫蠟至水，加3％過氧化氫10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉20 min，滴加一抗，4 ℃孵育24 h，滴加二抗，三抗室溫孵育各20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。EGFRv Ⅲ陽性評判標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞率＞10％。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用Χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GB患者中的EGFRv Ⅲ表達(dá)陽性組與陰性組的生存分析采用Kaplan-Meier法比較中位生存時間進(jìn)行分析。≥60歲的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的多因素分析采用Cox多因素回歸檢驗，計算OR值及其95％CI。

2　結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果 EGFRv Ⅲ染色主要定位于包膜與胞質(zhì)，呈棕黃色。EGFRvⅢ在GB組織（圖1A）和正常腦組織（圖1B）標(biāo)本的表達(dá)率分別為38.8％（38/98）和0％（0/18）。GB組織標(biāo)本EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)與正常腦組織標(biāo)本比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Χ2=10.38，P=0.001）。

圖1　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和正常腦組織免疫組化染色結(jié)果（SP，x400）

2.2單因素分析 為明確GB預(yù)后的危險因素，將多相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、KPS評分因素比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。性別、腫瘤發(fā)生的位置、是否為多發(fā)病灶、是否出現(xiàn)壞死因素比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床病理指標(biāo)與EGFRvⅢ表達(dá)的分析

2.3生存分析 采用Kaplan-Meier法對EGFRv Ⅲ陰性組與EGFRv Ⅲ陽性組中位生存時間進(jìn)行比較分析。EGFRvⅢ陰性組與陽性組的中位生存時間分別為13個月（95％CI，8.99～17.01）和12個月（95％CI，9.81～14.18），見圖2A。分析生存時間＞12個月的GB患者（48例），EGFRvⅢ陰性組和陽性組的中位總生存時間分別為22個月（95％CI，16.91～27.09）和16個月（95％CI，14.04～17.95），見圖2B。 ≥60歲和＜60歲兩組，中位總生存時間分別為10個月（95％CI，6.73～13.27）和15個月（95％CI，11.90～18.10），見圖2C。2.4 Cox多因素分析 ≥60歲的GB患者，進(jìn)行Cox多因素分析，發(fā)現(xiàn)KPS評分、EGFRvⅢ的表達(dá)是獨立預(yù)后相關(guān)因素，KPS評分與生存時間的OR（95％CI）=0.452（0.228～0.896），EGFRvⅢ的表達(dá)與生存時間OR（95％CI）=2.118（1.052～4.263），見表2。

表2 EGFRvⅢ、KPS評分對預(yù)后的多因素分析

3　討論

EGFR是一種相對分子質(zhì)量為17 Ku的跨膜蛋白受體，其擁有調(diào)控正常細(xì)胞分化、增殖與凋亡的功能，同時參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生等［3］。EGFRvⅢ則是EGFR的常見突變體，與EGFR的完整結(jié)構(gòu)相比，其胞外部分的2～7號外顯子缺失，導(dǎo)致801個堿基對缺失，使外顯子1和8相連接并融合產(chǎn)生一個新的氨基酸——甘氨酸，形成與野生型EGFR胞外區(qū)相比缺失6-273位氨基酸殘基的突變，即EGFRv Ⅲ［4］。因其喪失胞外配體結(jié)合區(qū)，可在無配體結(jié)合情況下激活酪氨酸激酶，產(chǎn)生自體磷酸化實現(xiàn)持續(xù)激活，目前普遍認(rèn)為這可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，因此使腫瘤組織增強對放療和化療的抵抗性，并增強細(xì)胞致瘤性和侵襲力，使其易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移［2］。在腦膠質(zhì)瘤中常發(fā)生EGFR基因擴增和基因重排現(xiàn)象，EGFRv Ⅲ除存在于膠質(zhì)瘤外，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌及前列腺癌等中均有發(fā)現(xiàn)。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，傳統(tǒng)的手術(shù)治療及放化療的療效不佳，平均生存期也僅為60～70周［5］。EGFRv Ⅲ作為一種常見的突變形式，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中約占40％［4］。既往的研究中未見EGRFv Ⅲ在正常腦組織中表達(dá)［6］。EGFRv Ⅲ在正常腦組織中缺失，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)的特性，使其成為一個理想的治療靶點［7］。研究顯示，EGFRv Ⅲ靶向治療措施如抗體、疫苗等已在體外細(xì)胞學(xué)試驗和動物模型中顯示出良好的抗腫瘤效應(yīng)［8］。因此，針對EGFRv Ⅲ靶向治療的藥物開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。

筆者主要討論了EGFRv Ⅲ與一些相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并對隨訪所得的資料進(jìn)行了生存分析。研究證明，EGFRv Ⅲ增強GB腫瘤細(xì)胞的侵襲力，在GB的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要作用，EGFRv Ⅲ是GB患者的不良預(yù)后因素，這與文獻(xiàn)［9］結(jié)論一致。但Shinojima等［10］研究發(fā)現(xiàn)，EGFRv Ⅲ的表達(dá)及EGFR的擴增并不會影響患者的術(shù)后中位總生存時間，這與本研究的結(jié)論相符合。筆者認(rèn)為EGFRv Ⅲ單獨存在時并不能影響整體的生存時間，當(dāng)EGFRv Ⅲ與其他一個或幾個因子協(xié)同發(fā)揮作用時才能表現(xiàn)出它的負(fù)面效應(yīng)。

單獨分析術(shù)后生存時間超過12個月的患者，發(fā)現(xiàn)陽性組中位總生存時間明顯低于陰性組。文獻(xiàn)［11］表明，對于術(shù)后生存時間超過12個月膠質(zhì)瘤患者EGFRvⅢ陽性表達(dá)水平是判斷其復(fù)發(fā)及預(yù)后的有效指標(biāo)，EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)越高，其復(fù)發(fā)率也越高，預(yù)后也越差，與本文結(jié)論一致。說明EGFRv Ⅲ對預(yù)后的影響可能并不能在短時間內(nèi)表現(xiàn)出來，在術(shù)后病程發(fā)展的過程中才會逐漸表現(xiàn)出其對預(yù)后的影響。

圖2　EGFRv Ⅲ陰性組與EGFRv Ⅲ陽性組底Kaplan-Meier生存曲線

本研究發(fā)現(xiàn)年齡是影響患者生存時間的重要因素，EGFRvⅢ在不同年齡段的作用值得更進(jìn)一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)，兒童的GB相比于成人的GB，EGFR及其突變體的表達(dá)在臨床意義上有明顯不同［12］。研究認(rèn)為EGFR基因擴增在成人的膠質(zhì)瘤中常見，但在兒童膠質(zhì)瘤中EGFR及其突變體非常少見也沒有明顯的作用［13］。成人的膠質(zhì)瘤患者中，EGFR基因擴增及EGFR突變體的表達(dá)在不同的年齡段中也發(fā)揮著不同的作用［14］。通常年齡越大的GB患者預(yù)后越差，本研究中EGFRv Ⅲ陽性表達(dá)并不影響整體GB患者的預(yù)后生存時間，但是EGFRv Ⅲ在≥60歲的GB患者中有著更高的表達(dá)，同時多因素相關(guān)分析表明EGFRv Ⅲ是≥60歲的GB患者的獨立預(yù)后相關(guān)因素。其高表達(dá)對≥60歲患者產(chǎn)生不良的預(yù)后。KPS評分也是影響預(yù)后的重要指標(biāo)。KPS功能狀態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)，得分越高，健康狀況越好，越能忍受治療給身體帶來的不良反應(yīng)，因而也就有可能接受徹底的治療。得分越低，健康狀況越差，若低于60分，許多有效的抗腫瘤治療就無法實施。

本研究中存在的不足之處有：研究對象均為經(jīng)手術(shù)治療的GB患者，而忽略了那些不能接受手術(shù)治療的患者，因此研究結(jié)果僅能代表接受手術(shù)的患者，而在面對所有GB患者時，結(jié)果并不一定準(zhǔn)確。另一方面因為本研究中患者樣本數(shù)量并不多，所以可能會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，如果能夠收集到更多的樣本數(shù)據(jù)，生存分析的結(jié)果將更有說服力?？陀^上由于不同的抗體及檢測技術(shù)、不完全的臨床資料、病理診斷的主觀性、評估標(biāo)準(zhǔn)的差異、腫瘤異質(zhì)性或者存在其他的生物學(xué)異常等等，也會與同類研究在研究結(jié)果上存在差異。

【參考文獻(xiàn)】

［1］Yang Z Y，Shen W X，Hu X F，et al.EGFR gene copy number as a predictive biomarker for the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR monoclonal antibodies：a meta-analysis［J］.J Hematol Oncol，2012，5（7）：1-9.

［2］Ning Y，Zeineldin R，Liu Y，et al.Down-regulation of integrin alpha2 surface expression by mutant epidermal growth factor receptor（EGFRv Ⅲ）induces aberrant cell spreading and focal adhesion formation［J］.Cancer Res，2005，65（20）：9280-9286.

［3］Normanno N，Luca A D，Bianco C，et al.Epidermal growth factor receptor（EGFR）signaling in cancer［J］.Gene，2006，366（1）：2-16.

［4］Wong A J，Ruppert J M，Bigner S H，et al.Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89（7）：2965-2969.

［5］Brat D J.Glioblastoma：biology，genetics，and behavior［J］.Am Soc Clin Oncol Educ Book，2012，32（32）：102-107.

［6］Aldape K D，Ballman K，F(xiàn)urth A，et al.Immunohisto chemical detection of EGFRvⅢ in high malignancy grade astrocytomas and evaluation of prognostic significance［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2004，63（7）：700-707.

［7］Bianco R，Troiani T，Tortora G，et al.Intrinsic and acquired resistance to EGFR inhibitors in human cancer therapy［J］.Endocr Relat Cancer，2005，12（Suppl 1）：S159-S171.

［8］Sampson J H，Archer G E，Mitchell D A，et al.An epidermal growth factor receptor variantⅢ -targeted vaccine is safe and immunogenic in patients with glioblastomamultiforme［J］.Mol Cancer Ther，2009，8（10）：2773-2779.

［9］Pelloski C E，Ballman K V，F(xiàn)urth A F，et al.Epidermal growth factor receptor variantⅢ status defines clinically distinct subtypes of glioblastoma［J］.J Clin Oncol，2007，25（16）：2288-2294.

［10］Shinojima N，Tada K，Shiraishi S，et al.Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multiforme［J］.Cancer Res，2003，63（20）：6962-6970.

［11］Heimberger A B，Hlatky R，Suki D，et al.Prognostic effect of epidermal growth factor receptor and EGFRvⅢ in glioblastoma multiforme patients［J］.Clin Cancer Res，2005，11（4）：1462-1466.

［12］Suri V，Das P，Pathak P，et al.Pediatric glioblastomas：a histopathological and molecular genetic study［J］.Neuro Oncol，2009，11（3）：274-280.

［13］Bax D A，Gaspar N，Little S E，et al.EGFRvⅢ deletion mutations in pediatric high-grade glioma and response to targeted therapy in pediatric glioma cell lines［J］.Clin Cancer Res，2009，15（18）：5753-5761.

［14］Lal A，Glazer C A，Martinson H M，et al.Mutant epidermal growth factor receptor up-regulates molecular effectors of tumor invasion［J］.Cancer Res，2002，62（12）：3335-3359.

（2016-02-23 收稿2016-05-23 修回）

（責(zé)任編輯宋宮儒）

Prognostic effect of epidermal growth factor receptor variant Ⅲ in glioblastoma

HONG Jiakang，LI Xin，and WANG Jianzhen. Department of Neurosurgery，Generl Hospital of Chinese People's Armed PoliceForces，Beijing 100039，ChinaCorresponding author：WANG Jianzhen，E- mail：wangjianzhen200588@163.com

【Abstract】Objective To investigate the influence of epidermal growth factor receptor variant Ⅲ（EGFRvⅢ）expression on the prognosis of patients with glioblastoma.Methods A total of 98 patients with glioblastoma were enrolled into this study from January 2012 to December 2015.The expression levels of EGFRv Ⅲ were detected by immunohistochemistry and analyzed their association with clinical parameters such as gender，age，tumor size，growth site and Karnofsky Performance Scale（KPS），etc.Results（1）The positive rate of EGFRv Ⅲ was 38.8％ in 98 cases of patients but 0％ in the normal.（2）Single factor analysis showed that age，KPS were statistically significantly different between EGFRv Ⅲ positive and negative groups（Χ2=7.018，P=0.008；Χ2=12.101，P=0.001）.（3）Survival analysis results showed that median survival time was 13 months（95％CI，8.99-17.01）in EGFRv Ⅲ negative group and 12 months（95％CI，9.81-14.18）in EGFRv Ⅲ positive group；the median total survival time over 12 months was 22 months（95％CI，16.91-27.09）in EGFRv Ⅲ negative group and 16 months（95％CI，14.04-17.95）in EGFRv Ⅲ positive group；the median total survival time was 10 months（95％CI，6.73-13.27）in patients over 60 years old and 15 months（95％CI，11.90-18.10）in patients under 60 years old.（4）Cox multiple factors analysis showed that KPS and positive expression of EGFRv Ⅲ were independent correlative factor of disease prognosis.Conclusions Positive expression of EGFRv Ⅲ，age and KPS are the risk factors influencing the prognosis of patients with glioblastoma.

【Key words】epidermal growth factor receptor variant Ⅲ；glioblastoma；prognosis

【中國圖書分類號】R730.264

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.06.004

作者簡介：洪家康，碩士研究生在讀，E-mail：376459319@qq.com

作者單位：100039 北京，武警總醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科

通訊作者：王建禎，E-mail：wangjianzhen200588@163.com