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過表達鋅指蛋白A20可抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)

2016-02-09 09:08:47朱曉丹宋元林白春學(xué)
中國臨床醫(yī)學(xué) 2016年6期
關(guān)鍵詞:肺泡細胞因子引物

朱曉丹, 王 穎, 畢 晶, 童 琳, 劉 潔, 宋元林, 白春學(xué)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科,上海 200032

ZHU Xiao-dan, WANG Ying, BI Jing, TONG Lin, LIU Jie, SONG Yuan-lin, BAI Chun-xue*

Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

論 著

過表達鋅指蛋白A20可抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)

朱曉丹, 王 穎, 畢 晶, 童 琳, 劉 潔, 宋元林, 白春學(xué)*

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科,上海 200032

目的:通過建立A20過表達肺泡巨噬細胞株,研究A20對肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響及調(diào)控機制。方法:構(gòu)建攜帶A20基因的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383),篩選出穩(wěn)定過表達A20基因的細胞株并行體外培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中加入脂多糖(LPS, 1 μg/mL)進行干預(yù),并于刺激后0.5、1、2、4 h收集上清液及細胞。ELISA法測定上清液中細胞因子(TNF-α、IL-1β)及核因子κB(NF-κB)活性。Western 印跡方法檢測A20蛋白及核內(nèi)p65含量。實時熒光定量PCR法測定A20 mRNA含量。結(jié)果:LPS刺激后,A20過表達組(A20組)及正常對照組(VEC組)A20蛋白及mRNA含量都升高,并于1 h達高峰,之后逐漸下降;且A20組較VEC組A20水平明顯升高(P<0.05)。與VEC組相比,A20組培養(yǎng)上清液中細胞因子(TNF-α、IL-1β)水平明顯降低(P<0.05);NF-κB DNA結(jié)合活性及核內(nèi)p65含量也降低(P<0.05)。結(jié)論:A20能夠抑制肺泡巨噬細胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β分泌,進而抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)活性。

急性呼吸窘迫綜合征;A20蛋白;肺泡;巨噬細胞;炎癥反應(yīng)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是造成重癥肺炎、重癥急性呼吸綜合征(SARS)、爆發(fā)性禽流感等疾病患者死亡的主要原因。ARDS病死率高,在美國,其死亡人數(shù)相當(dāng)于每年因乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡的人數(shù)總和[1]。其誘因主要為肺部感染和全身性感染。其中在脂多糖(LPS)導(dǎo)致的ARDS中,促炎及抗炎反應(yīng)失衡是根本原因。肺泡巨噬細胞在其中起始動作用,并與核因子(NF-κB)炎癥信號通路過度反應(yīng)密切相關(guān)[2-3]。

A20蛋白,又稱腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3),是一種泛素修飾酶[4]。既往研究[5-8]發(fā)現(xiàn),A20基因多態(tài)性與多種炎癥性疾病有關(guān),并可負性調(diào)節(jié)NF-κB。在呼吸系統(tǒng)中A20基因SNP位點(rs4755453)與急性肺損傷的易感性有關(guān)[9]。A20基因敲除小鼠能產(chǎn)生嚴重的炎癥反應(yīng),并在TNF-α及LPS干預(yù)之后更明顯,提示A20能夠抑制機體腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的NF-κB活化[10]。NF-κB在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中具有重要作用,而A20能夠調(diào)控NF-κB活化。因此本研究主要探討A20蛋白對肺泡巨噬細胞炎癥活性的影響。

1 材料與方法

1.1 肺泡巨噬細胞體外培養(yǎng) 選取NR8383大鼠肺泡巨噬細胞株(中國科學(xué)院細胞庫),采用含20%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基(Sigma,貨號:N3520),添加NaHCO32.5 g/L、1% P/S (100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)、2 mol/LL-谷氨酰胺溶液,置于37°C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2 A20質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用RT-PCR法(按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行,上游引物:5′-GTT GGC AAA GCA TAC AAC TGA AAG G-3′;下游引物:5′-GGC TGT GAC GAA GGA AGA GCT TA-3′)擴增小鼠A20 cDNA(購于康為世紀)。在EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ酶切位點將上述cDNA插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體,并進行測序驗證。按照LipofectamineTM2000 (Invitrogen,11 668-019)產(chǎn)品說明書將上述含有A20目的基因的載體轉(zhuǎn)染NR 8383肺泡巨噬細胞,并進行體外培養(yǎng),熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功。實時熒光定量PCR、Western 印跡法檢測細胞中A20基因和蛋白的表達。

1.3 LPS刺激肺泡巨噬細胞 將體外培養(yǎng)慢病毒包裝后的肺泡巨噬細胞株分為A20過表達組(A20組)和過表達空載組(VEC組)。向培養(yǎng)基中加入LPS(1 μg/mL)進行刺激,分別于刺激后0.5、1、2、4 h,將培養(yǎng)液離心,吸取上清液,并收獲細胞。細胞提取細胞蛋白及總RNA,采用Western 印跡法檢測A20、NF-κB蛋白表達情況,實時熒光定量PCR法檢測細胞中A20 mRNA表達情況(A20引物,上游引物:5′- GCA GTG TAA AAG GCA GGC TAA C-3′,下游引物:5′-TGG GGT TCT CTC TCG TAT CTT C-3′;β-actin引物上游引物:5′-GGA GATT AGT GCC CTG GCT CCT A-3′,下游引物:5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′)。

1.4 NF-κB活性及細胞因子檢測 用非放射性NF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子活性檢測試劑盒(Active Motif)檢測上清液中NF-κB活性;ELISA試劑盒(R&D)檢測上清液TNF-α、IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察A20過表達肺泡巨噬細胞 將攜帶A20基因的病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細胞(A20過表達肺泡巨噬細胞),感染24 h后,可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A20過表達肺泡巨噬細胞

A:明視野;B:熒光視野.Original magnification: ×200

2.2 A20過表達大鼠肺泡巨噬細胞的A20表達鑒定 采用Western 印跡及實時熒光定量PCR鑒定A20過表達肺泡巨噬細胞中A20的表達情況。結(jié)果顯示,A20過表達肺泡巨噬細胞(A20)中A20蛋白及mRNA含量較VEC組明顯升高,可用于后續(xù)研究(圖2)。

圖2 A20過表達肺泡巨噬細胞中A20表達情況

2.3 LPS刺激后大鼠肺泡巨噬細胞A20表達情況 VEC組及A20組LPS刺激后A20蛋白及mRNA含量均較刺激前升高,且于1 h達高峰,之后逐漸下降;LPS刺激后A20組中A20蛋白及mRNA的含量高于VEC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

2.4 A20對LPS刺激后肺泡巨噬細胞中細胞因子分泌的影響 LPS刺激后,與0 h比較,其他各個時間點各組細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-1β均明顯升高(圖4);A20組各個時間點較VEC組培養(yǎng)上清液中的細胞因子水平(TNF-α、IL-1β)均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明A20能抑制LPS刺激后肺泡巨噬細胞中的細胞因子分泌(圖4)。

圖3 各時間點肺泡巨噬細胞中A20蛋白及mRNA含量

圖4 ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α及IL-1β水平A:TNF-α水平;B:IL-1β水平.?P<0.05與0 h比較;*P<0.05與VEC組比較.n=3,

2.5 A20對LPS刺激后肺泡巨噬細胞中NF-κB的影響 給予LPS刺激后,與0 h比較,其他各個時間點各組核內(nèi)p65蛋白含量(圖5A、5B)及NF-κB DNA結(jié)合活性(圖5C)升高;與VEC組相比,A20組各個時間點核內(nèi)p65蛋白含量(圖5A、5B)及NF-κB DNA結(jié)合活性(圖5C)均降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明A20能抑制肺泡巨噬細胞NF-κB表達及活性。

3 討 論

過度放大的炎癥反應(yīng)是ARDS重要的病理生理特征,而肺泡巨噬細胞在其中起始動作用。通常認為,ARDS具有雙期炎癥過程,晚期依賴于中性粒細胞,早期肺泡巨噬細胞為啟動ARDS炎癥瀑布發(fā)揮著巨大作用[11]。當(dāng)外界刺激因子作用于機體時,首先激活巨噬細胞,釋放并活化一系列促炎因子,如TNF、IL-1、IL-6、IL-8等,進而作用于各種效應(yīng)細胞,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過度放大及失衡,最終造成ARDS。此外,肺巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子,因不能被血清滅活,而在肺內(nèi)不斷蓄積,使始動因素持續(xù)存在,造成ARDS繼續(xù)。在LPS所致的ARDS中,LPS能夠?qū)е路闻菥奘杉毎蠳F-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路過度反應(yīng),誘導(dǎo)上述細胞因子活化,進而造成肺損傷。因此,有效地抑制肺泡巨噬細胞中NF-κB活性可能是延緩或抑制ARDS炎癥反應(yīng)行之有效的方法。

圖5 LPS干預(yù)后肺泡巨噬細胞中A20、NF-κB蛋白表達及活性變化

A20是相對分子質(zhì)量約80 000的胞內(nèi)鋅指蛋白,最早在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中被發(fā)現(xiàn)。目前,它被認為是重要的炎癥負性調(diào)節(jié)因子。多種炎癥因子刺激,如LPS、IL-1β及CD40等,能夠誘導(dǎo)A20表達。本研究中,體外LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞后,A20表達增加,這與以往的研究[5]相似。本研究發(fā)現(xiàn),A20表達高峰期在LPS刺激后1 h,與IL-1β及TNF-α的分泌時相一致,提示A20與肺泡巨噬細胞細胞因子的分泌有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示,LPS刺激后該細胞株中A20蛋白及mRNA含量較VEC組明顯升高,而IL-1β及TNF-α水平明顯降低,表明A20能夠抑制肺泡巨噬細胞分泌IL-1β及TNF-α。研究[11-12]認為,IL-1β及TNF-α是與ARDS有關(guān)的主要近端細胞因子,在ARDS早期主要由巨噬細胞分泌,并通過刺激肺部的各種效應(yīng)細胞產(chǎn)生遠端細胞因子,起動細胞因子瀑布。本研究中A20能抑制這兩種細胞因子的分泌,提示A20可能通過抑制肺泡巨噬細胞分泌TNF-α及IL-β來調(diào)控ARDS。

NF-κB在細胞因子瀑布的調(diào)節(jié)中起重要作用[13-15]。在LPS誘導(dǎo)的ARDS中,NF-κB通路是主要的炎癥信號通路之一,它能夠調(diào)節(jié)多種促炎因子的表達及分泌,如TNF-α、IL-β、IL-6等。NF-κB的結(jié)合序列在巨噬細胞來源的很多細胞因子(包括TNF-α、IL-1β,IL-6和IL-8)啟動子中被發(fā)現(xiàn)。既往研究[4]發(fā)現(xiàn),A20能夠抑制NF-κB活化及TNF-α和IL-1誘導(dǎo)的信號通路傳導(dǎo)。NF-κB活化過程涉及多個蛋白的泛素化,包括MALT1、TRAF6,而A20蛋白能夠脫去這些蛋白的泛素化鏈,從而調(diào)控NF-κB的活化。本研究中給予LPS刺激后,與VEC組相比,A20組各個時間點核內(nèi)p65蛋白含量及NF-κB DNA結(jié)合活性都明顯降低,表明A20能抑制肺泡巨噬細胞NF-κB表達及活性。由于NF-κB能調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β分泌,故綜合以上研究結(jié)果,A20可能通過抑制NF-κB而調(diào)控TNF-α、IL-1β分泌,進而抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng),在ARDS炎癥反應(yīng)中起負性調(diào)節(jié)作用。

[1] RUBENFELD G D, CALDWELL E, PEABODY E, et al.Incidence and outcomes of acute lung injury[J].N Engl J Med, 2005,353(16):1685-1693.

[2] FUJIWARA N, KOBAYASHI K.Macrophages in inflammation[J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005,4(3):281-286.

[3] 馬杰飛,何義舟, 羅 哲,等.高遷移率族蛋白1在呼吸機相關(guān)性肺損傷大鼠中的表達變化[J].中國臨床醫(yī)學(xué), 2015,22(1): 29-32.

[4] IGARASHI H, YAHAGI A, SAIKA T, et al.A pro-inflammatory role for A20 and ABIN family proteins in human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J].Immunol Lett, 2012,141(2):246-253.

[5] SHEMBADE N, MA A, HARHAJ E W.Inhibition of NF-kappaB signaling by A20 through disruption of ubiquitin enzyme complexes[J].Science, 2010,327(5969):1135-1139.

[6] SONG X, YAO Z, YANG J, et al.HCV core protein binds to gC1qR to induce A20 expression and inhibit cytokine production through MAPKs and NF-κB signaling pathways[J].Oncotarget, 2016,7(23):33796-33808.

[7] VEREECKE L, BEYAERT R, VAN LOO G.Genetic relationships between A20/TNFAIP3, chronic inflammation and autoimmune disease[J].Biochem Soc Trans, 2011,39(4):1086-1091.

[8] FAN Y, TAO J H, ZHANG L P, et al.The association between BANK1 and TNFAIP3 gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus: a meta-analysis[J].Int J Immunogenet, 2011,38(2):151-159.

[9] SONG Z, YAO C, YIN J, et al.Genetic variation in the TNF receptor-associated factor 6 gene is associated with susceptibility to sepsis-induced acute lung injury[J].J Transl Med, 2012,10:166.

[10] LEE E G, BOONE D L, CHAI S, et al.Failure to regulate TNF-induced NF-kappaB and cell death responses in A20-deficient mice[J].Science, 2000,289(5488):2350-2354.

[11] ZHAO M, FERNANDEZ L G, DOCTOR A, et al.Alveolar macrophage activation is a key initiation signal for acute lung ischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006,291(5):L1018-L1026.

[12] MATTHAY M A, ZIMMERMAN G A.Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: four decades of inquiry into pathogenesis and rational management[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2005,33(4):319-327.

[13] MILLAR F R, SUMMERS C, GRIFFITHS M J, et al.The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities[J].Thorax, 2016,71(5):462-473.

[14] CASTELLHEIM A, BREKKE O L, ESPEVIK T, et al.Innate immune responses to danger signals in systemic inflammatory response syndrome and sepsis[J].Scand J Immunol, 2009,69(6):479-491.

[15] FAN J, YE R D, MALIK A B.Transcriptional mechanisms of acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2001,281(5):L1037-L1050.

[本文編輯] 廖曉瑜, 賈澤軍

A20 regulates the inflammatory responses of alveolar macrophage

Objective:To study the effects of A20 on the inflammatory response of alveolar macrophages and its regulation mechanism through establishing A20 over-expressing alveolar macrophage cell lines.Methods:Lentivirus-mediated expression vector carrying A20 gene was constructed, then it was transfected into rat alveolar macrophage cell lines (NR8383), and the cell lines which stably overexpressed A20 gene were screened and culturedinvitro.Lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) was added into the medium to intervene, the culture supernatants and cells were collected 0.5, 1, 2, 4 hours after stimulation, ELISA method was used to determine the activity of cytokines (TNF-α, IL-1β) and nuclear factor (NF-κB).Western blotting method was used to detect A20 protein and nuclear p65 content, and real-time fluorescence quantitative PCR method was used to determine the content of A20 mRNA.Results:After LPS stimulation, the levels of A20 protein and mRNA in A20 overexpression group (A20 group) and the normal control group (VEC group) both increased and reached the peak at 1 h, and then gradually decreased.The A20 level of A20 group was significantly higher than that of VEC group (P<0.05).Compared with VEC group, the levels of cytokines (TNF-α, IL-1β) in culture supernatants of A20 group significantly reduced (P<0.05), and the DNA binding activity of NF-κB and nuclear p65 content of A20 group also significantly reduced (P<0.05).Conclusions:A20 can inhibit the activity of NF-κB and the secretion of TNF-α and IL -1β, and then inhibit the inflammatory reaction activity of alveolar macrophages, thereby reducing the inflammatory response of acute respiratory distress syndrome (ARDS).

acute respiratory distress syndrome; A20 protein; alveolar; macrophage; inflammatory response

2016-08-19[接受日期]2016-11-01

國家自然科學(xué)基金青年基金(81300055,81500025),國家自然科學(xué)基金重點項目(30930090).Supported by National Natural Science Youth Foundation of China (81300055,81500025) and Key Project of National Natural Science Foundation of China (30930090).

朱曉丹,博士,住院醫(yī)師.E-mail: dan_yt@126.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990-2963, E-mail: bai.chunxue@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160822

R 563.8

A

ZHU Xiao-dan, WANG Ying, BI Jing, TONG Lin, LIU Jie, SONG Yuan-lin, BAI Chun-xue*

Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

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