張金慧， 杜洪靈， 周瓊青

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 上海 200060

短篇論著

葛根素在卵巢早衰患者中的免疫調(diào)節(jié)作用

張金慧， 杜洪靈， 周瓊青

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 上海 200060

目的：探討葛根素(Puerarin)對(duì)卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)患者的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：隨機(jī)選取抗卵巢抗體(AoAb)陽(yáng)性的POF患者40例，采用葛根素-安宮黃體酮序貫治療。在治療前和治療第12個(gè)周期采用Kupperman評(píng)分法評(píng)價(jià)該方法的臨床療效；并檢測(cè)患者AoAb，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，CD4+/CD8+值，CD19+B淋巴細(xì)胞，抗核抗體(ANA)等指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)治療過(guò)程中不良反應(yīng)的發(fā)生情況。結(jié)果：治療后患者的Kupperman評(píng)分、ANA轉(zhuǎn)陰率、AoAb轉(zhuǎn)陰率和AoAb濃度降低(P<0.05)。治療后CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯增加；而CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞， CD4+/CD8+比值，CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)明顯減少或降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kupperman評(píng)分改變與AoAb，CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)，ANA變化正相關(guān)(P<0.05)；Kupperman評(píng)分與CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：葛根素-安宮黃體酮序貫療法可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞功能來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，通過(guò)抑制CD19+B淋巴細(xì)胞的增殖及ANA、AoAb等的分泌來(lái)消除POF的免疫性損傷，從而實(shí)現(xiàn)卵巢的自我修復(fù)和功能恢復(fù)。

卵巢早衰；葛根素-安宮黃體酮序貫療法；抗卵巢抗體；抗核抗體；T淋巴細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞

女性40歲之前發(fā)生卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)的比率為1%～3%，其中抗卵巢抗體(antiovary antibody, AoAb)陽(yáng)性率達(dá)70%；自體免疫因素是其主要發(fā)病機(jī)制之一[1-2]。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素治療可以增加POF患者的雌激素水平，從而緩解POF的癥狀，但會(huì)引起其他不良反應(yīng)。前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，葛根素(Puerarin)具有有效緩解POF癥狀且不增加血雌激素水平和不誘發(fā)婦科腫瘤的優(yōu)點(diǎn)，部分患者甚至可以痊愈。本研究旨在探索葛根素是否具有通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能來(lái)抑制AoAb的產(chǎn)生，從而達(dá)到有效治療POF的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本課題組2012年1月1日至2014年12月治療POF患者共40例，年齡31～40歲，平均(36.12±4.32)歲；用藥時(shí)間12～31個(gè)周期，平均(24.22±7.64)個(gè)周期。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1) 符合POF診斷標(biāo)準(zhǔn)，AoAb陽(yáng)性；(2) 患者愿意采用葛根素+安宮黃體酮序貫治療。排除患有乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤，結(jié)核、血液病等病理性停經(jīng)，采用其他卵巢和女性激素藥物治療的患者。對(duì)照組采用張志君等[4]研究中的健康人群對(duì)照組。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。入選研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 用藥方法 應(yīng)用葛根片和安宮黃體酮序貫療法建立月經(jīng)人工周期?；颊呙咳湛诜鸶仄?野葛根提取物片，劑量為0.33 g/片，由上海仁濟(jì)大藥房提供；上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院檢測(cè)示，每片含有異黃酮0.429 mg)1片，1次/d，28 d為1個(gè)周期；于每個(gè)周期的19～28 d加安宮黃體酮10 mg口服，1次/d。對(duì)于已婚者應(yīng)用避孕套避孕，定期門診隨訪。

1.3 抗體檢測(cè) 檢測(cè)治療前和治療后第12個(gè)月經(jīng)周期患者的AoAb。月經(jīng)干凈后3 d抽患者空腹靜脈血，離心后低溫保存?zhèn)溆?。用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法[微粒子酶免疫分析法(MEIA)，德國(guó)羅氏診斷有限公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀]測(cè)定各對(duì)象血清卵泡制激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平。采用上海撫生實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的AoAb等抗體試劑盒，用ELISA法檢測(cè)血液AoAb。采用歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司的IgG檢測(cè)試劑盒，間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)。CD19+B淋巴細(xì)胞，CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群和CD4+/CD8+比值檢測(cè)，免疫標(biāo)化后應(yīng)用上海匯中細(xì)胞生物科技有限公司Cytocounter系列全自動(dòng)可視化細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.4 療效評(píng)價(jià) 采用Kupperman評(píng)分法[5]，按照更年期癥狀計(jì)分：潮熱出汗4分；失眠、煩燥、焦慮各2分；睡眠中斷、心悸、疲倦、緊張、抑郁、癢感和痛感、易哭、注意力不集中、陰道干燥、性欲減退、性交痛各占1分。每種癥狀的評(píng)分根據(jù)程度(無(wú)、輕、中、重)分別乘以0、1、2、3后計(jì)算總分，滿分為63分(最嚴(yán)重)。治療前后對(duì)照，降低的分?jǐn)?shù)作為療效評(píng)判指標(biāo)?？偡?分以下者，停藥3個(gè)周期。癥狀緩解，月經(jīng)規(guī)律且色、量正常判為治愈。癥狀部分緩解，停藥后療效難以維持者繼續(xù)按照標(biāo)準(zhǔn)用藥治療。

1.5 安全性評(píng)估 在用藥前和用藥后每半年體檢，進(jìn)行宮頸防癌涂片、乳腺、E2水平、肝腎功能等檢測(cè)，B超檢查子宮、卵巢的大小及子宮內(nèi)膜厚度等,以篩查雌激素相關(guān)性疾病。

2 結(jié) 果

2.1 POF患者的臨床療效評(píng)價(jià) 結(jié)果(表1)表明：治療后第12個(gè)周期患者的Kupperman評(píng)分較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40例患者中，治愈14例，治愈率為35%。與對(duì)照組相比，治療前患者的FSH、LH明顯增高(P<0.05)，E2明顯降低(P<0.05)。治療后患者的FSH和LH水平較治療前降低(P<0.05)，E2無(wú)明顯變化。治療后與對(duì)照組FSH和LH水平差異無(wú)顯著性，治療后E2較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。

2.2 POF患者的免疫指標(biāo)測(cè)定 用藥第12個(gè)月經(jīng)周期， CD19+B細(xì)胞計(jì)數(shù)及 CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+比值明顯減小，而CD8+計(jì)數(shù)明顯增加，AoAb濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。本組患者中有14例AoAb轉(zhuǎn)為陰性，轉(zhuǎn)陰率為35%；ANA陽(yáng)性率由90%下降到45%，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kupperman評(píng)分與AoAb濃度，CD3+、 CD4+T細(xì)胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B細(xì)胞數(shù)變化正相關(guān)(P<0.05)，而與CD8+T細(xì)胞數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ANA正相關(guān)。AoAb濃度變化與CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B細(xì)胞數(shù)變化正相關(guān)(P<0.05)，而與CD8+T細(xì)胞數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ANA正相關(guān)(P<0.05)。

2.3 不良反應(yīng) 患者在治療后2～3個(gè)月經(jīng)周期開始恢復(fù)月經(jīng)規(guī)律；6個(gè)周期后月經(jīng)色、量基本穩(wěn)定；12個(gè)周期時(shí)Kupperman評(píng)分比較穩(wěn)定，其中35%的患者治療12個(gè)周期評(píng)分5分以下，獲得治愈，停藥。因此，將第12個(gè)周期的指標(biāo)月經(jīng)水平用以評(píng)估療效，患者依從性好，結(jié)果較為準(zhǔn)確，之后的化驗(yàn)結(jié)果易受到其他環(huán)境和生活因素干擾。研究總計(jì)觀測(cè)12～31個(gè)周期，平均(24.22±7.64)個(gè)周期，發(fā)現(xiàn)月經(jīng)情況穩(wěn)定，葛根素治療耐受良好，均未發(fā)現(xiàn)明顯藥物不良反應(yīng)及乳腺、卵巢、子宮部位的雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生。

組 別nFSHzB/(U·L-1)LHzB/(U·L-1)E2ρB/(pg·L-1)Kupperman評(píng)分(分)對(duì)照組526．52±6．404．59±3．1951．5±8．870治療前4081．8±19．3?59．4±22．4?35．2±11．2?48．0±18．2治療后4022．3±17．6△25．4±17．2△39．1±15．4?21．0±13．6△

*P<0.05與對(duì)照組相比;△P<0.05與治療前相比

組 別nAoAbU/mLANACD19+BCD3+TCD4+TCD8+TCD4+/CD8+Kupperman評(píng)分(分)治療前406．91±2．3736457±1482261±4431152±337285±1491．54±0．8448±18．15治療后403．72±2．54?18?226±124?816±254?424±234?1067±385?0．83±0．24?21±13．57?

*P<0.05與治療前相比

3 討 論

POF免疫性損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，以AoAb介導(dǎo)的自身免疫性損傷被認(rèn)為是該病的主要發(fā)病機(jī)制。AoAb是自身免疫系統(tǒng)將卵巢組織作為抗原進(jìn)行攻擊而產(chǎn)生的自身抗體，主要包括抗透明帶抗體、抗顆粒細(xì)胞抗體和抗內(nèi)膜細(xì)胞抗體等[6]。其主要產(chǎn)生機(jī)制為：(1)排卵過(guò)程中卵泡破裂，免疫屏障暫時(shí)開放和部分細(xì)胞外溢，導(dǎo)致卵巢組織抗原暴露，產(chǎn)生自身抗體；(2)反復(fù)多次助孕穿刺取卵導(dǎo)致的卵巢組織免疫屏障破壞致使抗原性暴露，產(chǎn)生自身免疫；(3)炎癥、人流、痛經(jīng)、囊腫破裂、子宮內(nèi)膜異位等導(dǎo)致卵巢免疫屏障破壞[7]，相關(guān)抗原暴露誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生；(4)宮外孕、卵巢囊腫等手術(shù)直接導(dǎo)致屏障破壞和抗原暴露；(5)自身免疫功能異常導(dǎo)致產(chǎn)生一系列自身免疫性疾病等。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，POF患者AoAb、CD4、CD8等細(xì)胞因子均有異常，卵巢抗原暴露的同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，損害卵巢。卵巢免疫性損害的主要機(jī)制可能在于：(1)AoAb包裹卵細(xì)胞并影響其排出；(2)AoAb在補(bǔ)體作用下產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，破壞卵巢細(xì)胞，引起卵泡發(fā)育不全及POF；(3)AoAb干擾孕卵破殼而妨礙著床；(4)AoAb損害卵巢內(nèi)分泌功能，導(dǎo)致雌激素水平降低。CD19+B淋巴細(xì)胞代表B淋巴細(xì)胞總數(shù)及抗體分泌能力。而CD3+T淋巴細(xì)胞代表成熟T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞免疫水平。CD4+T淋巴細(xì)胞屬于輔助T細(xì)胞，而CD8+T淋巴細(xì)胞屬抑制性T細(xì)胞。CD4+/CD8+代表機(jī)體免疫狀態(tài)，明顯增高表示免疫機(jī)能處于過(guò)度活躍狀態(tài)，降低提示機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素-安宮黃體酮治療后，患者血液中AoAb和ANA水平均明顯下降，部分患者轉(zhuǎn)為陰性，而CD19+B細(xì)胞亞群數(shù)明顯下降，說(shuō)明機(jī)體抗體分泌水平降低；同時(shí)T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+，CD4+/CD8+比值均明顯降低，而CD8+亞群明顯增加，說(shuō)明T細(xì)胞系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮明顯作用。T細(xì)胞進(jìn)一步抑制B淋巴細(xì)胞抗體分泌，使得AoAb分泌減少或停止排放，卵巢的免疫性損害停止并在機(jī)體修復(fù)機(jī)制作用下得以康復(fù)。由于AoAb引起的卵巢炎在早期對(duì)原始卵泡影響較小且治療效果明顯，因此及早進(jìn)行AoAb測(cè)定對(duì)于不孕不育患者有重要意義。

葛根素治療前后Kupperman評(píng)分與AoAb濃度的變化均與CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，CD4+/CD8+比值，CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，而與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)負(fù)相關(guān)，反映了AoAb濃度的變化與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫水平之間的相關(guān)性。本研究結(jié)論支持POF以體液免疫為主的疾病，而非染色體異常所致的推測(cè)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素不但可以有效緩解POF的臨床癥狀，降低Kupperman評(píng)分，還可抑制FSH、LH分泌而不增加血液E2濃度，避免雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生，在部分患者中取得了治愈的效果。本研究在臨床效果、激素水平、安全性等都與前期研究取得了相似結(jié)果。治療后AoAb轉(zhuǎn)陰率達(dá)35%，濃度明顯降低，而ANA轉(zhuǎn)陰率45%，說(shuō)明葛根素-安宮黃體酮序貫治療對(duì)于AoAb、ANA都有明顯抑制作用。本研究還顯示，該療法無(wú)糖皮質(zhì)激素治療的不良反應(yīng)。

該序貫療法中，安宮黃體酮作為人工合成孕激素，無(wú)調(diào)節(jié)免疫的作用。葛根素可有效治療POF得益于葛根富含的異黃酮等20余種生物活性成分，其藥理作用主要有：(1)改善微循環(huán)，促進(jìn)組織血流，改善供血，有利于組織修復(fù)和功能恢復(fù)；(2)類雌激素作用可以部分替代雌激素作用而產(chǎn)生直接治療效果；(3)促進(jìn)炎性介質(zhì)疏散、緩解平滑肌痙攣，發(fā)揮解熱、解痙、消炎、鎮(zhèn)痛作用，緩解組織炎性反應(yīng)，對(duì)于局部炎癥起到直接治療作用，有利于自身修復(fù)；(4)加強(qiáng)細(xì)胞組織基底膜的修復(fù)作用，促使卵巢生物屏障的修復(fù)，隔離暴露的抗原，阻礙抗體產(chǎn)生；(5)直接作用于淋巴系統(tǒng)，抑制T細(xì)胞系統(tǒng)功能，干擾B淋巴細(xì)胞的分泌和釋放抗體能力，并影響其活性。研究提示葛根素治療卵巢早衰不是一種成分作用的結(jié)果，而是各種成分的多節(jié)點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多機(jī)制作用的結(jié)果[10]。應(yīng)充分發(fā)揮其安定心神、平衡免疫、增加營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)代謝的全身性治療作用。

POF患者的發(fā)病原因并不明確，有研究提出了卵巢自身抗體學(xué)說(shuō)、基因突變學(xué)說(shuō)等[11]，而葛根素-安宮黃體酮序貫療法可通過(guò)抑制AoAb產(chǎn)生或使其部分轉(zhuǎn)陰，從而抑制自身免疫對(duì)卵巢的損害，使紊亂的內(nèi)分泌軸重新獲得協(xié)調(diào)并“重啟動(dòng)”。大部分患者只是癥狀得到緩解或部分緩解，說(shuō)明POF患者的發(fā)病基礎(chǔ)呈多樣性，可能存在著難以治愈的病理基礎(chǔ)[12]。

[1] ROBLES A, CHECA M A, PRAT M, et al.Medical alternatives to oocyte donation in women with premature ovarian failure: a systematic review[J].Gynecol Endocrinol, 2013, 29(7):632-637.

[2] 劉素英，徐 軍，曹 翔，等.抗苗勒管激素對(duì)多囊卵巢綜合征卵巢反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2015,22(5):621-623.

[3] 張金慧,王慧麗,陳蓓蓓,等.葛根素-安宮黃體酮序貫療法治療卵巢早衰的臨床研究[J].中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健,2012,11(10):880-883.

[4] 張志君, 劉 惠.女性閉經(jīng)患者血清FSH、LH、PRL水平測(cè)定分析[J].中國(guó)性科學(xué), 2016, 25(9):29-31.

[5] KOKCU A.Premature ovarian failure from current perspective[J].Gynecol Endocrinol, 2010, 26(8):555-562.

[6] SASSARINI J, LUMSDEN M A, CRITCHLEY H O.Sex hormone replacement in ovarian failure- new treatment concepts[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2015,29(1):105-114.

[7] AYABE T, ISHIZUKA B, MARUYAMA T, et al.Association of primary ovarian insufficiency with a specific human leukocyte antigen haplotype (A*24:02-C*03:03-B*35:01) in Japanese women [J].Sex Dev, 2011, 5(5): 235-240.

[8] FRAWLEY R, WHITE K J R, BROWN R, et al.Gene expression in immune system pathways in the thymus after exposure to immunosuppessive chamicals[J].Environ Health Perspect, 2011, 119(3):371-376.

[9] GELBAYA T, VITTHALA S, NARDO L, et al.Optimizing hormone therapy for future reproductive performance in women with premature ovarian failure[J].Gynecol Endocrinol, 2011, 27(1):1-7.

[10] WEI S Y, CHEN Y, XU X Y.Progress on the pharmacological research of Puerarin: a review[J].Chin J Nat Med, 2014,12(6):407-414.

[11] WANG H, LI G, ZHANG J, et al.Novel WT1 missense mutations in Han Chinese women with premature ovarian failure[J].Sci Rep, 2015, 5:13983.

[12] FONSECA D J, PATIO L C, SUREZ Y C, et al.Next generation sequencing in women affected by onsyndromic premature ovarian failure displays new potential causative genes and mutations[J].Fertil Steril, 2015,104(1):154-162.

[本文編輯] 葉 婷， 曉 璐

Effect of Puerarin on the immune regulation of patients with premature ovarian failure

ZHANG Jin-hui, DU Hong-ling, ZHOU Qiong-qing

Department of Obstetrics and Gynecology, Putuo District People’s Hospital, Shanghai 200060, China

Objective：To discuss the immune regulation mechanism of Puerarin in patients with premature ovarian failure (POF), and to study the anti-ovary anti-body (AoAb), antinuclear antibody(ANA), CD3+, CD4+, CD8+T lymphocyte cell and CD4+/CD8+and changes of CD19+B lymphocyte cell before and after treatment.Methods：Totally 40 POF cases with AoAb positive, treated with Puerarin-progesterone sequential treatment, were random selected.The clinical efficacy was analyzed before treatment and at the 12th cycle of treatment by using Kupperman, and the AoAb, CD3+, CD4+, CD8+T cells and CD4+/CD8+, CD19+B lymphocyte cell，ANA and other indicators were recorded and analyzed.The incidence rate of adverse reactions in the treatment process was recorded.Results：Kupperman score, ANA negative rate, AoAb negative rate and concentration of antibody after treatment were significantly decreased (P<0.05).The CD8+T cell counts increased significantly, while the CD3+, CD4+T cells, CD4+/CD8+, CD19+B lymphocytes were significantly reduced after treatment (P<0.05).Kupperman score was positively correlated with the number of AoAb, CD3+, CD4+T cells, CD19+B cell count, and ANA (P<0.05), and negative correlated with CD8+T cell count (P<0.05).Conclusions：Puerarin-progesterone sequential treatment is a safe and effective method for the POF.Puerarin may regulate immune function through the CD3+, CD4+and CD8+T cells, eliminate the immune injury of the POF by inhibiting the CD19+B cell, and secretion of ANA and AoAb to realize the self-repairing and functional recovery of ovarian.

premature ovarian failure; puerarin-progesterone method; anti-ovary antibody; antinuclear antibody; T cell; B cell

2016-08-13[接受日期]2016-11-05

上海市普陀區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基金(KW15201).Supported by the Putuo District Science and Technology Project of Shanghai (KW15201).

張金慧，副主任醫(yī)師.E-mail: zjinhui68@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160804

R 711.75

A