宋紅花， 王勇軍， 吳尤佳， 孫寶蘭

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科, 南通 226001 2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南通 226001

論 著

多疣壁虎纖維連接蛋白在壁虎脊髓斷尾再生中的表達(dá)變化及作用

宋紅花1， 王勇軍2*， 吳尤佳1， 孫寶蘭1

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科, 南通 226001 2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南通 226001

目的：通過研究多疣壁虎纖維連接蛋白(fibronectin, FN)在多疣壁虎斷尾再生過程中的表達(dá)變化及其對Gsn3增殖、遷移和細(xì)胞突起生長的影響，初步探討FN在脊髓再生中的作用及可能機(jī)制。方法：應(yīng)用簡并PCR技術(shù)從多疣壁虎組織中獲得FN的一段特異性EST序列。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reation, qRT-PCR)技術(shù)檢測壁虎斷尾損傷脊髓中FN mRNA的變化。用體外人源FN蛋白培養(yǎng)壁虎少突膠質(zhì)細(xì)胞系Gsn3細(xì)胞，DiI染色觀察FN對Gsn3細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響；Transwell技術(shù)檢測FN對Gsn3細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果：在壁虎斷尾損傷后再生脊髓遠(yuǎn)側(cè)端，F(xiàn)N mRNA表達(dá)急劇上調(diào)，在斷尾后1 d表達(dá)最高，隨著時(shí)間延長逐漸下降。在體外，人源FN促進(jìn)壁虎Gsn3細(xì)胞增殖和遷移，但不能使細(xì)胞突起伸長。結(jié)論：FN可能通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移參與壁虎斷尾后脊髓的再生。

纖維連接蛋白；再生；Gsn3細(xì)胞；增殖；遷移

高等動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷后的再生與功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生失敗是由于不能激活神經(jīng)元生長能力，且周圍環(huán)境中存在生長抑制因子及缺少營養(yǎng)支持[1]。纖維連接蛋白(fibronectin, FN)是一種重要的營養(yǎng)因子，是胞外基質(zhì)復(fù)合物的重要組成成分。FN至少是11種不同整聯(lián)蛋白異二聚體的配體，促進(jìn)細(xì)胞的黏附[2]。大量研究表明，F(xiàn)N參與多種組織的損傷和修復(fù)。成體高等動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能再生，而低等動(dòng)物卻具有很強(qiáng)的再生能力，如多疣壁虎脊髓損傷后能夠進(jìn)行自我修復(fù)與再生。胞外基質(zhì)中的FN是否參與壁虎脊髓的再生過程的相關(guān)研究較少。壁虎少突膠質(zhì)細(xì)胞Gsn3由Liu等[3]于2012年首次構(gòu)建。此后的研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，壁虎Gsn3參與了壁虎脊髓損傷的再生，如壁虎斷尾再生過程中，糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 的下調(diào)促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞突起的生長，從而參與損傷脊髓的再生。

本研究通過建立壁虎脊髓損傷模型，初步探討FN在脊髓再生過程中的表達(dá)變化及其對Gsn3細(xì)胞的影響，為后續(xù)深入研究FN參與神經(jīng)再生的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 成年多疣壁虎(Gekko japonicus)雌雄各5只，大小均一，體質(zhì)量為(3.0±0.5) g，體長為(5.7±0.2) cm，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，DMEM/F12、DMEM、FBS購自Gibco公司，人源FN購自Sigma公司、DiI 染色液購自Sigma公司、Transwell 購自BD公司、ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 簡并PCR獲得FN特異性EST序列 用TRIzol試劑提取壁虎組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈。根據(jù)其他各物種蛋白質(zhì)的同源性，設(shè)計(jì)FN的簡并引物：上游引物 5′-CGG CGG GAC AAC ATG aart ggt gyg g-3′，下游引物 5′-CGA TGC CCC TGC CGt arc art arc a-3′。用簡并PCR擴(kuò)增特異性EST序列。將此序列測序后與NCBI上的其他序列進(jìn)行比對。

1.2.2 Real-time PCR檢測FN mRNA 在多疣壁虎斷尾再生中的表達(dá)變化 以擴(kuò)增出的EST序列為模板，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物。其中上游引物5′-GAC AAG CAG CAC GAC ATG G-3′，下游引物5′-CCC TTC TTC GTG GCG TTT-3′。用TRIzol提取壁虎斷尾0 d、1 d、3 d、1周、2周脊髓下段的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：SuperMix-UDG with ROX 12.5 μL、上游和下游引物各0.5 μL、模板 1 μL、 ddH2O 10.5 μL。 反應(yīng)程序如下：93℃ 2 min，93℃ 30 s，62℃ 30 s；共40個(gè)循環(huán)。以真核生物延伸因子基因1α(eukaryotic elongation factor-1α，EF-1α)為內(nèi)參基因。

1.2.3 壁虎Gsn3細(xì)胞克隆株的培養(yǎng)及FN處理 Gsn3細(xì)胞于30℃、5% CO2條件下，在含1% 雙抗、10% FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d 后，細(xì)胞融合度達(dá)80%，用胰酶消化片刻后重懸，進(jìn)行傳代擴(kuò)增。用購買的人源FN以2 μg/cm2鋪皿培養(yǎng)壁虎Gsn3細(xì)胞，2 d后用DiI染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 Transwell檢測Gsn3細(xì)胞遷移情況 制備Gsn3細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入含30 μg/mL FN的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2 d，用無鈣PBS洗2次，甲醇固定30 min后，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3次。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 FN在多疣壁虎斷尾脊髓再生過程中的表達(dá)變化 將簡并PCR擴(kuò)增得到的EST序列與NCBI上的其他序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，此序列與其他物種FN基因的高度同源。以此EST序列為模板設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，對脊髓再生過程中FN的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：以EF-1α基因作為參照，斷尾損傷后，F(xiàn)N mRNA表達(dá)上調(diào)，斷尾后1 d FN的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)最高，然后逐漸下降(P<0.01，圖1)。

2.2 人源FN對壁虎Gsn3細(xì)胞增殖的影響 用人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養(yǎng)Gsn3細(xì)胞2 d后，DiI染色結(jié)果顯示，F(xiàn)N處理后細(xì)胞的數(shù)量明顯增多(P<0.05，圖2)。

2.3 人源FN對壁虎Gsn3細(xì)胞突起生長的影響 人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養(yǎng)Gsn3細(xì)胞2 d后，DiI染色結(jié)果顯示，F(xiàn)N蛋白處理細(xì)胞的突起長度與對照組差異比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.4 人源FN對壁虎Gsn3細(xì)胞遷移的影響 人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養(yǎng)Gsn3細(xì)胞2 d后甲醛固定，結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，F(xiàn)N處理細(xì)胞的遷移數(shù)量較對照組明顯增多(P<0.01，圖4)。

圖2 人源FN對壁虎Gsn3細(xì)胞增殖的影響Orignial magnification: ×10.*P<0.05與control組比較; n=3,

圖3 FN對Gsn3細(xì)胞突起生長的影響Orignial magnification: ×20.n=3,

圖4 FN對Gsn3細(xì)胞遷移的影響Orignial magnification: ×20.**P<0.01與control組比較；n=3,

3 討 論

壁虎是一種再生能力很強(qiáng)的脊椎動(dòng)物，斷尾后能夠再生出原有的尾部結(jié)構(gòu)，其中包括脊髓的再生。由于壁虎在進(jìn)化上更加接近高等動(dòng)物，因此其斷尾損傷模型成為研究高等動(dòng)物中樞神經(jīng)再生的良好模型。通過對壁虎斷尾再生機(jī)制的研究，能為人類神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)研究提供線索。多疣壁虎斷尾損傷后，首先是斷尾處愈傷上皮再生，然后是頂端復(fù)層上皮帽狀結(jié)構(gòu)(AEC)形成，接著是芽基的形成和尾部延伸。在壁虎脊髓損傷再生過程中，有多種營養(yǎng)因子和信號調(diào)節(jié)分子參與其中。

FN是一種高分子糖蛋白，廣泛存在于細(xì)胞表面、細(xì)胞外液、基膜和結(jié)締組織，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。FN參與細(xì)胞多種生理功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和聚集等。FN在機(jī)體內(nèi)的分布和含量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。FN可直接影響腫瘤的生物學(xué)行為，如促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[6-7]。FN除在癌癥中發(fā)揮重要作用外，還參與機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)和再生過程。FN是肌肉源性干細(xì)胞的優(yōu)先附著底物，老年小鼠骨骼肌干細(xì)胞龕中FN水平的降低會(huì)損害肌肉源性干細(xì)胞的功能和骨骼肌的再生能力[8]。中性粒細(xì)胞合成的FN對骨折愈合有明顯的促進(jìn)作用[9]。此外，F(xiàn)N作為細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與傷口的愈合與皮膚的再生[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，斷尾損傷后FN mRNA表達(dá)上調(diào)，斷尾后第1天達(dá)最高，然后逐漸下降，但在脊髓再生過程中持續(xù)高表達(dá)。這一結(jié)果與上述研究中FN參與組織損傷修復(fù)的結(jié)果相一致。FN在脊髓損傷的第1天表達(dá)最高，可能是因?yàn)闄C(jī)體受到斷尾損傷后發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而大量分泌FN，促進(jìn)傷口的愈合和愈傷上皮的形成。愈傷上皮形成以后，后續(xù)部分的再生關(guān)鍵是神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生。大量研究[11-12]表明，F(xiàn)N支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元突起的萌發(fā)與軸突的再生。研究[13]也表明，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的FN在體外誘導(dǎo)神經(jīng)突起的生長和促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生。因此，可以初步斷定FN參與了壁虎神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，少突膠質(zhì)細(xì)胞扮演了重要的角色。少突膠質(zhì)細(xì)胞在髓鞘形成和神經(jīng)電信號的傳遞過程中起重要作用，同時(shí)能維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。所以本實(shí)驗(yàn)選擇壁虎少突膠質(zhì)細(xì)胞作為體外研究對象。本研究采用人源FN培養(yǎng)Gsn3細(xì)胞的主要原因有3個(gè)：第一，由于現(xiàn)階段還沒有商品化的壁虎FN蛋白，其來源受到限制；第二， FN基因及其功能在進(jìn)化過程中保守性很高，因此可以采用人源FN，若異源性FN對Gsn3細(xì)胞有作用，那么可以間接表明同源性FN對Gsn3細(xì)胞的作用；第三，我們研究的最終目的是為人類的脊髓損傷再生提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究中，F(xiàn)N在多疣壁虎斷尾脊髓再生過程中的表達(dá)增加；FN體外培養(yǎng)壁虎Gsn3細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。這提示壁虎在脊髓損傷后大量神經(jīng)細(xì)胞死亡的情況下，F(xiàn)N可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移到受損部位并大量增殖，參與髓鞘形成和保護(hù)受損的神經(jīng)元。因此認(rèn)為，少突膠質(zhì)細(xì)胞替代療法是治療脊髓損傷的一個(gè)潛在的有效策略。FN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)中的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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[本文編輯] 姬靜芳

Effect and expression changes of fibronectin on spinal cord regeneration of Gekko japonicus

SONG Hong-hua1, WANG Yong-jun2*, WU You-jia1, SUN Bao-lan1

1.Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China 2.Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China

Objective：To observe expression changes of fibronectin (FN) and its effect on Gsn3 proliferation, migration and oligodendrocyte of spinal cord regeneration of Gekko japonicus, and also analyze the effects and possible mechanism of FN involved in spinal cord regeneration.Methods：Using degenerate PCR to obtain a special EST sequence of FN from Gekko japonicus tissue.The expression changes of FN mRNA in the regenerating spinal cord after tail amputation were detected by real-time quantitative polymerase chain reation (qRT-PCR).In vitro, the human FN was used to culture Gekko oligodendrocyte cell line (Gsn3 cells).The morphology and proliferation of Gsn3 cells after FN treatment were also observed by DiI staining, whereas the migration was detected by Transwell.Results：During the Gekko spinal cord regeneration, FN mRNA expression is significantly increased at 1 dpa (1-day post amputation) then decreased gradually with the time extension in distant spinal cord.FN is able to promote the proliferation and migration of Gsn3 cells, but could not promote the extension of process in vitro.Conclusions：FN participates in spinal cord regeneration by affecting oligodendrocyte proliferation and migration.

fibronectin; regeneration; Gsn3 cells; proliferation; migration

2016-07-22[接受日期]2016-12-14

國家自然科學(xué)基金(31471011).Supported by National Natural Science Foudation of China (31471011).

宋紅花，碩士，研究實(shí)習(xí)員.E-mail: song_hong_hua@126.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0513-85051818, E-mail: wyjbs@ntu.edu.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160751

R 322.8

A