趙菲佚，焦成瑾，唐　紅，康濤濤，安建平（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

紫花苜蓿不同品種酯酶同工酶分析

趙菲佚，焦成瑾，唐紅，康濤濤，安建平★
（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)8個(gè)紫花苜蓿品種酯酶同工酶染色譜帶、相似性指標(biāo)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，各品種酯酶同工酶在酶譜上均有表達(dá)，并呈現(xiàn)較強(qiáng)的特異性，8個(gè)品種存在一條共有同工酶條帶。8個(gè)供試苜蓿品種共獲得19條酶帶，品種間酯酶同工酶表達(dá)存在顯著差異。表達(dá)最多的品種有4條，最少為1條。部分苜蓿品種同工酶譜帶存在相似性，而各同工酶的表達(dá)量存在差異。各品種酶譜聯(lián)合系數(shù)計(jì)算結(jié)果表明：德寶和甘農(nóng)三號(hào)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，新疆大葉和三得利之間的親緣關(guān)系最近。

苜蓿；酯酶同工酶；電泳；酶譜聯(lián)合系數(shù)；親緣關(guān)系

紫花苜蓿為多年生豆科牧草，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，能生長(zhǎng)在多種類型的氣候、土壤環(huán)境下，是世界上栽培最早、面積最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的牧草，有“牧草之王”的美稱，因此在我國(guó)被廣泛種植。在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于在同一地區(qū)需種植不同品種的紫花苜蓿，或從其它地區(qū)進(jìn)行引種進(jìn)行種植示范，使得對(duì)于紫花苜蓿不同品種的鑒定成為必要。由于紫花苜蓿在形態(tài)外觀上各不同品種差異不大，僅從形態(tài)很難對(duì)不同品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。近年來發(fā)展的分子標(biāo)記鑒定方法，可從核酸水平上達(dá)到此目標(biāo)。［1-3］然而，由于紫花苜蓿栽培種大多數(shù)在遺傳上屬于同源4倍體，且無法通過常規(guī)測(cè)序方法進(jìn)行全基因組測(cè)序，目前主要使用RAPD法以篩選或建立組合分子標(biāo)記方法進(jìn)行不同品種的鑒定。此方法具有較好的鑒定效果，但也存在需要合成大量的隨機(jī)引物，且需要昂貴的核酸電泳凝膠成像系統(tǒng)。因而在條件不具備的地區(qū)存在因難。酯酶同工酶是目前在品種鑒定中應(yīng)用最多的酶類，酯酶（Ester?ase，EST）是具有多態(tài)性的一組同工酶，是生物體內(nèi)廣泛存在的水解酶類，酯酶同工酶是目前已發(fā)現(xiàn)的諸多同工酶中基因位點(diǎn)比較多（一般2～10個(gè)）的一種酶，在生物體內(nèi)廣泛存在，［4］已有研究表明，它在種系鑒定中具有重要的參考價(jià)值，［5］已廣泛應(yīng)用于魚腥草［6］、菌株［7］、昆蟲［8］等生物種的鑒定中。利用酯酶同工酶分析技術(shù)可以揭示群間或居群內(nèi)甚至居群以下不同個(gè)體間或親緣種之間的遺傳上的變異，從而揭示同一個(gè)種內(nèi)不同居群和同一個(gè)居群不同個(gè)體在遺傳上的多樣性。［9-10］因而以酯酶同功酶為標(biāo)記，以聚丙烯凝膠電泳分析技術(shù)，通過對(duì)酯酶同工酶特征來鑒定不同的紫花苜蓿品種。為苜蓿的引種、育種、品種改良與栽培提供依據(jù)。

本研究使用同工酶電泳技術(shù)，對(duì)8個(gè)在我省進(jìn)行種植的紫花苜蓿品種進(jìn)行了多樣性研究，目的在于研究8個(gè)供試紫花苜蓿品種間的多樣性和親緣關(guān)系。試驗(yàn)對(duì)8個(gè)紫花苜蓿品種的酯酶同工酶進(jìn)行非變性凝膠電泳分析，考察不同品種的酯酶同工酶的表達(dá)狀況，并對(duì)其進(jìn)行聚類，為苜蓿的分型與育種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料與培養(yǎng)

供試的8個(gè)紫花苜蓿品種阿爾岡金、潤(rùn)布勒、隴東苜蓿、三得利、甘農(nóng)3號(hào)、德寶、新疆大葉和德福均來自天水農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，其編號(hào)、中文名稱、拉丁名稱及原產(chǎn)地見表1.材料培養(yǎng)為將供試材料的種子取適量在50 ml燒杯中經(jīng)6～8 h吸脹后種于人工培養(yǎng)土中，培養(yǎng)土的組成為：壤土：粗沙：泥炭土：蛭石=1：1：1：1，培養(yǎng)間溫度為22～25℃，濕度50%～70%，16 h光，8 h暗培養(yǎng)。待長(zhǎng)出3片真葉后取其葉片進(jìn)行總蛋白提取。

1.2試驗(yàn)方法

表1　供試紫花苜蓿（Medicago sativa L.）材料及其來源

1.2.1葉片總蛋白提取

剪取8種供試苜蓿鮮葉各0.5 g置于預(yù)冷研缽中，加入少量石英砂，研磨過程中依次加入2 ml預(yù)冷0.1 M Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），研磨樣品勻漿后迅速移入預(yù)冷的2 ml離心管，4℃下12 000 rpm離心15 min，取8種不同品種苜蓿上清液0.8 ml置于新離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總蛋白非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

試驗(yàn)使用非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法。［11］分離膠濃度為8%，濃縮膠為4%.電極緩沖液為Tris-甘氨酸電極緩沖液（pH 8.0）。提取總蛋白樣品20 μl加入3 μl 6x蛋白載樣緩沖液。初始電壓60 V，約30 min后樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑前沿移至分離膠底部約1.5 cm時(shí)停止電泳并剝膠。

1.2.3非變性聚丙烯酰胺凝膠染色

聚丙烯酰胺凝膠染色使用醋酸聯(lián)苯胺法，將電泳后的凝膠浸入染色液（100 ml磷酸緩沖液染液中含50 mg乙酸-α-萘酯、50 mg乙酸-β-萘酯和200 mg堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽）中，室溫下約20 S后出現(xiàn)染色酶帶至清晰時(shí)停止染色過程，取出后用ddH2O漂洗，進(jìn)行拍照。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

酶譜帶遷移率（Rf）計(jì)算：Rf=酶帶遷移距離（cm）/溴酚蘭遷移距離（cm）。［10］按酶帶的相對(duì)遷移率、顏色深淺、寬度以及染色酶帶數(shù)目標(biāo)定酶帶位置。［11］根據(jù)所統(tǒng)計(jì)酶譜帶的有無和強(qiáng)弱，將酶譜條帶分為強(qiáng)帶、較強(qiáng)帶、弱帶和無條帶。計(jì)算不同品種每種譜帶的相對(duì)遷移率和相似系數(shù)。使用公式：S=2w/（a+b）×100%對(duì)8個(gè)苜蓿不同品種酯酶同工酶酶譜相似系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。公式中a，b，w分別代表a品種，b品種和a、b品種共有的酶帶數(shù)，其中S以小數(shù)表示。

2　結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿不同品種EST同工酶分析

為考察不同紫花苜蓿品種的酯酶同工酶表達(dá)的差異，在前述試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，對(duì)不同品種苜蓿的粗酶液進(jìn)行了提取，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，使用酯酶同工酶染色液進(jìn)行染色，結(jié)果如圖1所示。

圖1　8種供試苜蓿品種酯酶同功酶酶譜分布

圖1結(jié)果表明，8種供試苜蓿品種共呈現(xiàn)19條酶帶，表明8種苜蓿中酯酶同工酶均有表達(dá)。在6種不同遷移率的同工酶帶中，C-4條帶為8種苜蓿共有，品種3、4、5、6、7、8缺失C-1條帶，品種1、2、3、4、8缺失C-2帶，品種1、5、6、7、8無C-3帶，C-5帶為品種2、5共有，C-6帶為品種5所獨(dú)有。供試苜蓿品種共有一條主酶帶，其中品種2、5各自出現(xiàn)4條酶帶，品種8出現(xiàn)1條酶帶，品種1、3、4、6、7各自出現(xiàn)2條酶帶。供試苜蓿品種出現(xiàn)不同的酶帶，且其同工酶的活性也存在差異，此表明8種苜蓿中的酯酶同工酶在遺傳上存有差異。品種3酶帶著色最深、條帶最寬，預(yù)示其酯酶同工酶活性最強(qiáng)，其他7種苜蓿酯酶酶帶著色較淺，酯酶同工酶活性較低，且品種間存在差異，呈現(xiàn)酯酶同工酶在不同的苜蓿品種間具有多態(tài)性。

2.2各供試材料酶帶相對(duì)遷移率的計(jì)算

以苜蓿酯酶同工酶分析為基礎(chǔ)，為考察不同品種間的親緣關(guān)系，對(duì)所獲得的酯酶同工酶譜帶計(jì)算其相對(duì)遷率（Rf），結(jié)果如表2所示。

表2　酯酶同功酶酶帶相對(duì)遷移率

由表2可知，8個(gè)紫花苜蓿品種酯酶同工酶譜帶遷移率（Rf）在0.1818～0.8545之間，共檢測(cè)到19條酶帶，1條特征譜帶；酶帶條數(shù)最多的是品種5，有4條；酶帶數(shù)量最少的是品種8，只有1條帶。另外，在8種紫花苜蓿中，C-6僅為品種5所特有。各苜蓿不同品種酯酶譜帶相互區(qū)別，可作為品種鑒定的特征酶帶。

2.3酶譜聯(lián)合系數(shù)S的計(jì)算

為考察苜蓿不同品種間的親緣關(guān)系，對(duì)酯酶同工酶計(jì)算酶譜聯(lián)合系數(shù)。計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3　苜蓿不同品種酯酶酶譜聯(lián)合系數(shù)矩陣表

由表3可知，聯(lián)合系數(shù)S在0～2之間變化，其值越大，兩品種親緣關(guān)系越近，越小親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。品種3和品種4的聯(lián)合系數(shù)最?。⊿=0.5000），品種6和品種7之間的聯(lián)合系數(shù)為1.5000，它們的酶帶數(shù)均為2條，酶帶位置也相同，但其酶活性存在差異。品種1和品種2之間，品種2和品種3、4之間，品種5和品種6、7號(hào)之間的聯(lián)合系數(shù)均為1.6667，親緣關(guān)系十分相近。其余幾個(gè)品種之間親緣關(guān)系介于上述親緣關(guān)系之間。表明其親緣介于上述品種之間。

3　討論

本研究使用非變性PAGE對(duì)8個(gè)苜蓿品種酯酶同功酶進(jìn)行了分析，結(jié)果可檢測(cè)到共19條酯酶同工酶帶，有6種遷移率不同的酶帶。8種苜蓿中酯酶同工酶均可得到表達(dá)。此外，聯(lián)合系數(shù)計(jì)算和分析表明，德寶和甘農(nóng)三號(hào)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，新疆大葉和三得利之間的親緣關(guān)系最近。

8個(gè)苜蓿品種酯酶同工酶在不同的苜蓿品種間，存在不同品種間的共有酶帶，也同樣具有單個(gè)品種的特有酶帶，使得不同品種間的譜帶可進(jìn)行區(qū)別。同工酶酶譜具有較高的多態(tài)性水平，品種間相似系數(shù)越小則表明該品種間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，品種3和品種1這兩個(gè)品種間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。8個(gè)苜蓿品種的Rf值介于0.1818～0.8545之間且都具有一條主條帶，顯示出其遺傳穩(wěn)定性，6條不同遷移率的酶帶表現(xiàn)其多態(tài)性現(xiàn)象。8個(gè)品種的酯酶同工酶在酶帶數(shù)、各條帶染色強(qiáng)度上存在差異，表明品種之間存在遺傳差異，經(jīng)過長(zhǎng)期演化，親緣關(guān)系有所改變，各自在特定的生長(zhǎng)環(huán)境或不同的進(jìn)化過程中已發(fā)生趨異分化，［15］這可作為苜蓿種間鑒定的一個(gè)標(biāo)志。

酯酶同工酶酶帶數(shù)目、遷移率Rf及酶活性上的差異，可用于了解某一植物組織或器官的某些同工酶帶在一定發(fā)育時(shí)期的出現(xiàn)以及在有外界環(huán)境條件影響時(shí)這些酶帶減弱或消失，或者在不同品種植物中同工酶也表現(xiàn)出不同的特征，這種現(xiàn)象說明分化基因作用和環(huán)境條件影響都會(huì)使植物產(chǎn)生生理生化上的差異。［12-13］因而，在使用酯酶同工酶技術(shù)鑒定植物不同品種時(shí)也應(yīng)通過形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)等研究相結(jié)合而最終予以確認(rèn)結(jié)果的正確性。發(fā)展更加簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的以同功酶為基礎(chǔ)的品種鑒定方法是未來研究的重點(diǎn)。

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〔責(zé)任編輯 王小風(fēng)〕

S551+.703

A

1671-1351（2016）02-0019-03

2016-01-23

趙菲佚（1972-），男，江蘇鎮(zhèn)江人，天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院副教授，博士。

安建平（1965-），男，甘肅秦安人，天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院教授。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260568，31160060）及天水市科技局2010年科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目階段性成果