唐朝穎韓維舉鄧雄威王方園袁碩龍楊仕明吳南

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聾病教育部重點實驗室（北京100853）

2中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心（北京100190）

·基礎(chǔ)研究·

CMC-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體體外轉(zhuǎn)染效果評估

唐朝穎1韓維舉1鄧雄威2王方園1袁碩龍1楊仕明1吳南1

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聾病教育部重點實驗室（北京100853）

2中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心（北京100190）

目的構(gòu)建羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體（CTNs），探究CTNs介導(dǎo)miR96轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜的效率及安全性，為miR96在內(nèi)耳的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用羧甲基化的殼聚糖（CMC）與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽合成CTNs，攜帶標(biāo)記花青染料熒光（cy3）的miR96模擬物（miR96 mimics），轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜，利用激光共聚焦熒光顯微鏡對293細(xì)胞和耳蝸基底膜鋪片進(jìn)行熒光陽性細(xì)胞計數(shù)，以陽離子脂質(zhì)體作為對照，評價轉(zhuǎn)染效率，采用MTT試驗評價CTNs的安全性。結(jié)果成功制備了CTNs，納米顆粒平均直徑約186.6nm，粒徑分布集中，無明顯聚集現(xiàn)象；CTNs-miR96-cy3轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的平均陽性細(xì)胞率為32.6%,轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜毛細(xì)胞的平均陽性細(xì)胞率為24.4%，均低于陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3；MTT試驗示CTNs細(xì)胞毒性低于陽離子脂質(zhì)體。結(jié)論CTNs作為一種新型的納米載體，可攜帶miR96成功轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜，提示了納米載體作為miRNA載體的可行性，并且安全性較高，但轉(zhuǎn)染效率不足。

羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體；miRNA；miR96；內(nèi)耳轉(zhuǎn)染

National High-tech R&D Program of China for Young Scientists(2014AA020510),National Natural Science Foundation of China (81470683),Innovation and drive power engineering project of China association for science and technology（2016CXQD01），National Basic Research Program of China(973 Program)(2012CB967900,It's Branch programs 2012CB967901,2012CB967903).

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在小鼠耳蝸中高表達(dá)，其中miR96被證實與耳蝸毛細(xì)胞的分化、發(fā)育及人類聽力損失密切相關(guān)[1-5]。選擇合適的載體將miR96遞送至內(nèi)耳是實現(xiàn)其外源性干預(yù)的關(guān)鍵。最常用的載體為病毒載體和非病毒載體。病毒載體有誘發(fā)免疫反應(yīng)、潛在致癌等風(fēng)險，使其體內(nèi)應(yīng)用受限。近年來，非病毒載體逐漸成為研究熱點，其中，納米載體以其無免疫原性、可生物降解性及生物相容性等優(yōu)勢，成為較理想的miRNA載體。

羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體（CTNs），是由羧甲基化的殼聚糖（CMC）與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過自組裝方式合成的納米顆粒[6]。CMC具有良好的生物相容性及幾乎無毒性，產(chǎn)物無毒、可被生物體吸收，且可溶于水的聚合材料[7-8]。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是人類免疫缺陷病毒1型編碼的帶正電荷多肽，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的外源生物大分子通過生物膜和生理屏障，達(dá)到高轉(zhuǎn)染率[9-10]。盡管CTNs已成功用于miRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，并能夠?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的功能調(diào)控[6]，但其用于內(nèi)耳遞送miRNA研究未見報道。本研究以乳鼠耳蝸基底膜為研究對象，以CTNs為miR96載體，評價標(biāo)記花青染料熒光（cy3）的miR96 mimics的轉(zhuǎn)染效率，探索非病毒載體攜帶miR96內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的可行性并為其在耳聾基因治療研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 293細(xì)胞培養(yǎng)

293細(xì)胞（解放軍總醫(yī)院泌尿外科實驗室）是一種貼壁生長細(xì)胞，將293細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS，Gibco）的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，于37℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日換液，細(xì)胞生長融合約80%時可傳代。

1.2 耳蝸基底膜培養(yǎng)

將出生3天的乳鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）消毒，顯微鏡下于L-15培養(yǎng)液(Gibco)中剝離耳蝸基底膜；將離體基底膜轉(zhuǎn)移至10ul DMEM/F-12培養(yǎng)液(Gibco)中，鋪平；將平鋪的基底膜放入37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱5分鐘，至基底膜完全吸附在培養(yǎng)皿玻底上，加入2mL DMEM/F-12培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日換液。

1.3 CTNs-miR96-cy3復(fù)合物的制備和表征

①CTNs-miR96-cy3復(fù)合物的制備（國家納米科學(xué)中心）將0.02mg miR96 mimics(廣州銳博生物科技有限公司)溶于100uL去核酸酶水中，與1mL 1.5mg/mL羧甲基殼聚糖水溶液混合；將1mL 1mg/mL的TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽水溶液逐滴加入1mL濃度不等（0.25-4.0mg/mL）的miR96/羧甲基殼聚糖水溶液中，室溫下磁力攪拌器攪拌，室溫孵育20分鐘，納米復(fù)合物形成后，溶液變渾濁，將2mL混合物移至微量離心管中，離心（12000g）10分鐘將納米顆粒收集于管底；棄去上層液體，將納米顆粒重懸于去核酸酶水中，備用。

②CTNs-miR96-cy3復(fù)合物表征測定 應(yīng)用激光粒度儀（Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK）測定納米顆粒直徑大小及Zeta電位。取1mL CTNs-miR96-cy3復(fù)合物水溶液樣品，在室溫25℃，633nm激光波長，恒定溫度90o條件下測定，每個樣品重復(fù)3次。用透射電子顯微鏡以200KV激發(fā)電壓觀察樣品形態(tài)[6]。

1.4 293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將處于對數(shù)生長期的293細(xì)胞消化，傳代于玻底24孔板中，接種密度約為3×105個，每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)基0.5mL，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿約70%左右，備轉(zhuǎn)染。設(shè)對照組、陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組、CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組（miR96轉(zhuǎn)染濃度為150nM）。陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物制備方法參照LipofectamineTM3000（invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染后于37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10分鐘，免疫組化備用。激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss）下，采用計數(shù)的方式，取5個視野每100個細(xì)胞分別計數(shù)cy3熒光陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性率。

1.5 耳蝸基底膜的轉(zhuǎn)染

耳蝸基底膜培養(yǎng)24小時，有成纖維細(xì)胞生長，無污染的情況下可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)對照組、陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組、CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組（miR96轉(zhuǎn)染濃度為150nM）。轉(zhuǎn)染后于37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞2小時，免疫組化備用。計數(shù)方法同293細(xì)胞，計數(shù)耳蝸基底膜毛細(xì)胞。

1.6 293細(xì)胞/耳蝸基底膜的免疫組化染色

固定過的293細(xì)胞/耳蝸基底膜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍；用0.25%TritonX-100溶液透膜，15分鐘后PBS沖洗3遍；加入100nM鬼筆環(huán)肽（cytoskel?eton）工作液200ul，避光染色30分鐘后PBS沖液沖洗3遍；加入適量DAPI(雷根生物技術(shù)有限公司)工作液，染色10分鐘，PBS沖洗3遍；加入適量PBS,至覆蓋293細(xì)胞/耳蝸基底膜，激光共聚焦顯微鏡觀察cy3熒光情況。

1.7 MTT細(xì)胞毒性試驗

將處于對數(shù)生長期的293細(xì)胞傳代于96孔板，每孔3×103個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時。陽性對照組和實驗組加入運載150nM miR96的陽離子脂質(zhì)體和CTNs空載體，設(shè)空白對照組，每組重復(fù)6孔，37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，向每孔加入10微升MTT溶液（5mg/ml,碧云天生物技術(shù)研究所），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。每孔加100微升Formanzan溶解液，繼續(xù)孵育。至顯微鏡下觀察formazan全部溶解。于570nm測定光密度值（OD），OD值越大表示細(xì)胞毒性越小。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。轉(zhuǎn)染效率的研究，計算陽離子脂質(zhì)體、CTNs轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜的陽性率，數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗。載體安全性方面研究，對陽離子脂質(zhì)體、CTNs、對照組進(jìn)行MTT試驗，對OD值進(jìn)行獨立樣本t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTNs的表征

將CMC和TAT按1.5mg/1mg(1.5:1)質(zhì)量比混合后，可獲得粒徑大小約為186.6nm，zeta電位為-30.9mV的納米顆粒。電鏡示納米顆粒外觀呈均一球形，分散均勻，無明顯聚集現(xiàn)象，動態(tài)散射光下粒徑分布集中，如圖1所示。電鏡下及動態(tài)光散射測得CTNs-miR96-cy3復(fù)合物的直徑和表面電荷與CTNs無明顯差別，說明納米顆粒包封miR96不會改變納米顆粒的理化特性。

圖1 CTNs的表征Fig.1 Characterization of CTNsA：納米顆粒的透射電鏡圖 B：納米顆粒的粒徑分布圖A:TEM image of CTNs B:Particle size distribution of CTNs

2.2 陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物與CTNS-miR 96-cy3復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞熒光觀察

如圖2，陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組和CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組293細(xì)胞內(nèi)均可見cy3紅色熒光，陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組胞質(zhì)內(nèi)熒光較強，呈點狀分布于胞核周圍，兩組細(xì)胞形態(tài)良好，對照組胞質(zhì)內(nèi)未見紅色熒光。陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組和CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組平均陽性細(xì)胞率分別為87.4±1.82%、32.6±2.97% (見表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-31.19,P=0.000）。

圖2 不同載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的熒光情況 箭頭示293細(xì)胞中miR96-cy3紅色熒光（60）Fig.2 Red fluorescence in 293 cells of different carriers White arrows show the red fluorescence of miR96-cy3 in 293 cells（60）A：對照組 B：陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組 C：CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組A:Control group B:Lipofectamine--miR96-cy3 complexes group C:CTNs-miR96-cy3 complexes group

2.3 陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物與CTNs-miR 96-cy3復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜熒光觀察

如圖3，陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組和CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組耳蝸基底膜均可見cy3紅色熒光，陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組熒光較強，兩組熒光在內(nèi)耳毛細(xì)胞內(nèi)呈均勻分布，在內(nèi)毛細(xì)胞中熒光略增強，兩組基底膜形態(tài)良好，對照組胞質(zhì)內(nèi)未見紅色熒光。毛細(xì)胞中，陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組和CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組平均陽性細(xì)胞率分別為56.6±2.70%、24.4±1.82%（見表1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.12,P=0.000）。

表1陽離子脂質(zhì)體和CTNs轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比較（**P＜0.01）

Table1 Comparasion of miR96 mimics transduction efficiency between lipofectamine and CTNs（±s，%） Cell style 293 cells Hair cells

Carrier Lipofectamine 87.4±1.82% 56.6±2.70% CTNs

32.6 ±2.97%**

24.4 ±1.82%**

2.4 陽離子脂質(zhì)體與CTNs的安全性評估

MTT試驗測定陽離子脂質(zhì)體與CTNs的安全性，以O(shè)D值作為評估標(biāo)準(zhǔn)。如圖4，對照組、陽離子脂質(zhì)體和CTNs三組的平均OD值為1.334±0.092、1.095± 0.017、1.227±0.071。CTNs組OD值高于陽離子脂質(zhì)體組（t=-4.436,P=0.005），空白對照組OD值高于陽離子脂質(zhì)體組(t=6.297,P=0.001）。

圖3 不同載體轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜的熒光情況 箭頭示毛細(xì)胞中miR96-cy3紅色熒光Fig.3 Red fluorescence in cochlear basilar membrane of different carriers White arrows show the red fluorescence of miR96-cy3 in hair cellsA：對照組 B：陽離子脂質(zhì)體-miR96-cy3復(fù)合物組 C：CTNs-miR96-cy3復(fù)合物組A:Control group B:Lipofectamine--miR96-cy3 complexes group C:CTNs-miR96-cy3 complexes group

圖4 MTT試驗測定陽離子脂質(zhì)體與CTNs的細(xì)胞毒性，**P＜0.01Fig.4 Comparasion of cytotoxicity between lipofectanmine and CTNs by MTT assay**P＜0.01

3 討論

miRNA是一種長度約21個核苷酸的非編碼序列，抑制mRNA翻譯或斷裂靶mRNA，抑制基因表達(dá)[11]。miRNA是一種至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在哺乳動物中，調(diào)控約30%的蛋白編碼基因，幾乎參與所有細(xì)胞的增殖、分化、生長發(fā)育等過程[12]。miR96的突變可能與人類漸進(jìn)性非綜合征性感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)[3-4]。因此，通過miRNA外源干預(yù)技術(shù)調(diào)控miR96可能為治療感音神經(jīng)性耳聾的突破點，本研究選用的miR96 mimics與天然成熟miRNA作用方式相同，具有相同的抑制基因表達(dá)的作用[13]，miRNA不穩(wěn)定的特性及耳蝸的特殊解剖結(jié)構(gòu)，為其高效靶向性的進(jìn)入耳蝸作用部位增加了難度。

納米材料做為載體遞送基因或藥物以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但應(yīng)用納米載體向內(nèi)耳遞送miRNA仍處于初級階段。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是一種帶有正電荷的細(xì)胞膜穿透肽，通過共價結(jié)合或靜電作用結(jié)合核酸，可以通過幾乎所有磷脂雙分子層，但TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過內(nèi)吞作用介導(dǎo)的基因跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)基因調(diào)控效率較低，可能與其無法內(nèi)含體逃逸有關(guān)，并且易被體內(nèi)蛋白酶降解，因此體內(nèi)應(yīng)用效率低[6]。羧甲基殼聚糖是一種殼聚糖羧衍生物，通過在-OH基團(tuán)導(dǎo)入-CH2COOH基團(tuán)，形成衍生物羧甲基殼聚糖，具有良好的水溶性[7]。將羧甲基殼聚糖與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過自組裝的方法合成的納米顆粒，作為miRNA載體轉(zhuǎn)染率高，并且可在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在[6,14]。本研究成功制備了直徑約為186.6nm的CTNs，呈均一球形，分散均勻，無明顯聚集現(xiàn)象，符合納米載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳粒徑條件，穩(wěn)定性好，可避免被免疫系統(tǒng)識別、吞噬。

本研究中用陽離子脂質(zhì)體作為對照評價CTNs作為miR96載體的轉(zhuǎn)染率和安全性。本研究結(jié)果顯示CTNs作為miR96載體的體外轉(zhuǎn)染效率明顯低于陽離子脂質(zhì)體，可能與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽結(jié)合殼聚糖后，導(dǎo)致其理化特性和表面電荷改變有關(guān)。TAT可以無選擇性的高效通過所有生物膜，包括血腦屏障[10]，TAT結(jié)合殼聚糖對TAT的暴露程度影響較大，暴露差導(dǎo)致其轉(zhuǎn)導(dǎo)活性降低。有研究證實，適當(dāng)長度的生物大分子與TAT結(jié)合，可是使TAT暴露程度達(dá)到最佳，從而高效的介導(dǎo)生物大分子進(jìn)入細(xì)胞[15]。另外，與生物大分子結(jié)合的TAT的密度對其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有影響，但不能確定TAT密度與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的量效關(guān)系[16]。將CMC和TAT按1.5mg/1mg(1.5:1)質(zhì)量比混合，雖然可以獲得較高的合成效率，但可能TAT的暴露不是適合于耳蝸感覺細(xì)胞的最佳比例或密度，因此，降低了復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率，應(yīng)用于內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的最佳比例仍需進(jìn)一步優(yōu)化。另外，TAT結(jié)合殼聚糖導(dǎo)致其表面正電荷的減少，影響其與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，從而降低其轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。關(guān)于CTNs的安全性方面，本研究示攜帶相同濃度miR96的CTNs的細(xì)胞毒性明顯低于陽離子脂質(zhì)體，細(xì)胞相容性良好，為CTNs的體內(nèi)研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

綜上所述，本研究以CTNs為載體攜帶miR96成功轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜，且細(xì)胞毒性較低，提示了CTNs作為miRNA載體的可行性。但其未來的應(yīng)用仍需進(jìn)一步優(yōu)化構(gòu)建條件以提高轉(zhuǎn)染效率。另外，全身用藥治療耳蝸疾病的最大障礙是藥物無法通過血-迷路屏障，TAT可介導(dǎo)外源性物質(zhì)通過血-腦屏障，對其是否能介導(dǎo)跨血-迷路屏障轉(zhuǎn)運的進(jìn)一步研究，有可能為耳蝸疾病的治療提供新的思路。

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Transduction efficiency and cytotoxicity evaluation of CMC-TAT nanocarriers in vitro

TANG Chaoying1,HAN Weiju1,DENG Xiongwei2,WANG Fangyuan1,YUAN Shuolong1,YANG Shiming1,WU Nan1
1 Department of Otorhinolaryngology，Head and Neck Surgery，Chinese PLA General Hospital, The Key Laboratory of Deaf Disease,Ministry of Education,Beijing 100853,China
2 National Nanotechnology Center of Chinese Academy of Science,Beijing 100190,China

ObjectiveTo construct O-carboxymethy chitosan-TAT nanoparticles（CTNs）,and to explore the efficiency and security of CTNs for miR96 by transfect 293 cells and cochlear basilar membrane.MethodThe CTNs were generated with the optimal weight ratio of 1.5:1(CMC:TAT),which were used for the incorporation with miR-96 mimisc marked cy3. Transfect 293 cells and cochlear basilar membrane with Lipofectamine-miR96-cy3 and CTNs-miR96-cy3 at the concentration of 150nM with control.The red fluorescence positive cells were counted to evaluate the efficiency of CTNs.The security of CTNs was evaluated by MTT assay.ResultCTNs with a size of 186.8 nm and a zeta potential of-30.9 mV were successfully prepared.The transduction efficiency of CTNs-miR96-cy3 was lower than that of Lipofectamine-miR96-cy3 in both 293 cells and cochlear basilar membrane.MTT assay showed that the cytotoxicity of CTNs was significantly lower than that of Lipofectamine.ConclusionCTNs can successfully transduct miR96 in vitro,which reveals the feasibility and security of CTNs as delivery vector for miRNAin cochlea，however,it’s transduction efficiency is low.

O-carboxymethy chitosan-TAT Nanocarriers;miRNA;miR96；Transfection in cochlea

R764.35

A

1672-2922（2016）06-793-5

2016-12-12審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.018

國家863青年科學(xué)家項目（2014AA020510），國家自然科學(xué)基金面上項目（81470683），中國科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動助力工程（2016CX?QD01）,國家973計劃重大科學(xué)研究計劃干細(xì)胞項目（2012CB967900,其子課題:2012CB967901,2012CB967903）。

唐朝穎，博士研究生，研究方向：耳科學(xué)

唐朝穎和韓維舉為并列第一作者

吳南，Email:maxpanda1979@126.com