張 良 張 翼 唐秋紅 林楚偉 周勝華

(1 湖南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市 410005，E-mail：iarry@sina.com；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科，長沙市 410011；3 長沙市中心醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市410004；4 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市 410011)

論著·基礎(chǔ)研究

腫瘤壞死因子-α對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中組織蛋白酶K表達(dá)的影響

張 良1張 翼1唐秋紅2林楚偉3周勝華4

(1 湖南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市 410005，E-mail：iarry@sina.com；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科，長沙市 410011；3 長沙市中心醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市410004；4 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙市 410011)

目的 觀察不同濃度腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和不同TNF-α作用時間對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中組織蛋白酶K(Cat K)表達(dá)的影響。方法 取對數(shù)生長期HUVEC進行實驗。將HUVEC分為正常對照組、0.1 ng/ml TNF-α組、1 ng/ml TNF-α組、10 ng/ml TNF-α組、100 ng/ml TNF-α組，分別采用DMEM培養(yǎng)基、0.1 ng/ml TNF-α、1 ng/ml TNF-α、10 ng/ml TNF-α、100 ng/ml TNF-α作用24 h。另取HUVEC分為對照組、TNF-α 6 h組、TNF-α 12 h組、TNF-α 24 h組、TNF-α 48 h組，對照組DMEM培養(yǎng)基作用24 h，其他組采用10 ng/ml TNF-α作用相應(yīng)時間。檢測各組HUVEC中的Cat K mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對照組比較，不同TNF-α濃度組的Cat K mRNA和Cat K蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。0.1 ng/ml TNF-α組、1 ng/ml TNF-α組、10 ng/ml TNF-α組Cat K mRNA和Cat K蛋白的表達(dá)水平依次增高(P<0.05)，100 ng/ml TNF-α組Cat K mRNA和Cat K 蛋白表達(dá)水平較10 ng/ml TNF-α組下降(P<0.05)。與對照組比較，TNF-α各作用時間組Cat K mRNA和Cat K蛋白的表達(dá)水平增高(P<0.05)；TNF-α 6 h組、TNF-α 12 h組、TNF-α 24 h組Cat K mRNA和Cat K蛋白的表達(dá)水平依次增高(P<0.05)；TNF-α 48 h組Cat K mRNA和Cat K蛋白的表達(dá)水平較TNF-α 24 h組明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 在一定作用濃度及作用時間內(nèi)，TNF-α可以呈劑量和時間依賴性刺激HUVEC中Cat K表達(dá)。TNF-α可能通過促進Cat K的表達(dá)促進動脈硬化的發(fā)生。

組織蛋白酶K；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；動脈硬化

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，可以調(diào)控多種炎癥因子和生長因子的表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，動脈硬化兔血清TNF-α水平升高，血清TNF-α水平是心血管疾病危險因素，也是預(yù)測艾滋病毒感染者冠狀動脈鈣化的危險因素，提示TNF-α與動脈硬化發(fā)生有關(guān)系[1-2]。組織蛋白酶(cathepsin，Cat)K是組織蛋白酶家族中的重要成員，能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)遷移，在人動脈硬化斑塊中可見Cat K蛋白及基因表達(dá)水平增高[3]；冠心病患者血清Cat K水平升高，并且Cat K可能是預(yù)測冠心病的生物標(biāo)志物[4-5]。Keegan等[6]發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cat K的表達(dá)，但是兩者之間的時效和量效關(guān)系尚未完全清楚。本研究旨在探討TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中Cat K表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料 HUVEC購自中科院上海細(xì)胞庫，人TNF-α購自PeproTech公司(批號300-01A)，杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeceo′s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清購自上海Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司(批號00216965)，總RNA提取試劑Trizol-Reagent購自Invitrogen公司(批號204014)，瓊脂糖購自SABC公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)maker購自天根公司，PCR引物由上海英駿生物公司提供，Cat K 抗體(Abcam公司 批號ab120950-9)、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽取試劑盒購自Beyotime 公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)：HUVEC用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶放入37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d換液一次，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時傳代，取傳至3～4代的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 不同濃度TNF-α(母液濃度為1 000 ng/ml)的配制：按以下方法稀釋：100 μl母液加入900 μl DMEM，得到100 ng/ml TNF-α；取100 μl 100 ng/ml TNF-α加入900 μl DMEM，得到10 ng/ml TNF-α；取100 μl 10 ng/ml TNF-α加入900 μl DMEM，得到1 ng/ml TNF-α；取100 μl 1 ng/ml TNF-α 加入900 μl DMEM，得到0.1 ng/ml TNF-α。1.2.3 實驗分組：(1)不同濃度TNF-α對HUVEC表達(dá)Cat K的影響：① 正常對照組：采用DMEM培養(yǎng)HUVEC 24 h；② 0.1 ng/mlTNF-α組：采用終濃度0.1 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 24 h；③ 1 ng/ml TNF-α組：采用終濃度1 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 24 h；④ 10 ng/ml TNF-α組：采用終濃度10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 24 h；⑤ 100 ng/mlTNF-α組：采用終濃度100 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 24 h。每組均設(shè)復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。(2)不同時間10 ng/ml TNF-α對HUVEC表達(dá)Cat K的影響：① 對照組：采用DMEM培養(yǎng)HUVEC 24 h；② TNF-α 6 h組：采用終濃度10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 6 h；③ TNF-α 12 h組：采用終濃度10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 12 h；④ TNF-α 24 h組：采用終濃度10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 24 h；⑤ TNF-α 48 h組：采用終濃度10 ng/ml的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 48 h。每組均設(shè)復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。1.2.4 實時定量熒光PCR測定HUVEC中Cat K mRNA表達(dá)：將收集的HUVEC采用Trizol方法提取總RNA。取5 μl RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取5 μl cDNA模板行PCR。根據(jù)GeneBank(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000001.11?report=genbank&from=150796208&to=150808441)的基因序列，采用Primer 5軟件設(shè)計引物。引物由上海英駿生物公司合成。Cat K上游引物序列為：5′-ACTGGACTCAAAGTACCCCT-3′，下游引物序列為5′-GCCATCATTCTCAGACACAC-3′，長度為258 bp；選擇β-肌動蛋白(β-Actin)作為半定量內(nèi)對照引物，上游引物序列為：5′-ACACAGTGCTGTCTGGCG-3′，下游引物序列為5′-ATTTGCGGTGGACGATGG-3′，長度為234 bp。擴增條件為：95℃ 5 min預(yù)變性后，94℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共38個循環(huán)。最后72℃延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物5 μl點樣于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，嗅化乙啶染色，紫外分光光度計觀察電泳結(jié)果。Cat K和內(nèi)參照β-actin的PCR產(chǎn)物長度分別是234 bp和258 bp，以Cat K/β-actin的A比值來表示Cat K mRNA在HUVEC的表達(dá)情況。1.2.5 Western blot檢測HUVEC中Cat K蛋白的表達(dá)：用磷酸緩沖鹽溶液清洗誘導(dǎo)分化成熟的各組HUVEC 2次，收集細(xì)胞并分瓶，按1 ml裂解液加100 mM苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)10 μl，搖勻置于冰上。每微量離心管細(xì)胞加100 μl含PMSF的裂解液裂解，在4℃ 12 000 r/min離心10 min，將離心后的上清和還原型5×十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液以4 ∶1比例以每管總25 μl體積分裝轉(zhuǎn)移至0.2 ml的微量離心管，以100℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，變性蛋白質(zhì)放于-80℃保存。蛋白上樣量為每孔30 μg， 10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，10%膠用200 mA轉(zhuǎn)移80 min左右。將膜放入含5%牛血清白蛋白和含0.1%吐溫20的氨丁三醇緩沖液(tris-buffered saline and tween 20，TBST)室溫下封閉 1～2 h，一抗(Cat K 1 ∶1 000稀釋)，4℃過夜。TBST 洗膜 10 min×3次，二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫1 h，TBST洗膜10 min×3次，電化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光。 采用Quantity One軟件進行圖像分析，使用高斯建模得出灰度分析值。以Cat K/β-actin的A比值來表示Cat K蛋白在HUVEC的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)性分布的計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析來進行多組間比較，不符合正態(tài)性分布的均數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TNF-α對HUVEC中Cat K mRNA表達(dá)的影響 正常對照組HUVEC未見Cat K mRNA表達(dá)；其余4組經(jīng)不同濃度TNF-α刺激24 h后均可見Cat K mRNA表達(dá)，表達(dá)水平均高于正常對照組(F=1 578.768，P<0.001)。在0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml TNF-α組中，隨著TNF-α濃度的增加，Cat K mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05)，100 ng/mlTNF-α組Cat KmRNA的表達(dá)水平低于10 ng/ml TNF-α組(P<0.05)。表1及見圖1。

表1 不同濃度TNF-α刺激24 h各組HUVEC中Cat K mRNA表達(dá)情況(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與10 ng/ml TNF-α組比較，#P<0.05；與1 ng/ml TNF-α組比較，▲P<0.05。

圖1 Cat K和β-actin mRNA在HUVEC中表達(dá)的電泳圖

注：l為正常對照組；2為0.1 ng/ml TNF-α組；3為1 ng/ml TNF-α組；4為10 ng/ml TNF-α組；5為100 ng/ml TNF-α組。

2.2 不同濃度TNF-α對HUVEC中Cat K 蛋白表達(dá)的影響 正常對照組HUVEC未見明顯Cat K蛋白表達(dá)；其余4組給予不同濃度TNF-α刺激24 h后均可見Cat K蛋白表達(dá)，且表達(dá)水平均高于正常對照組(F=206.188，P<0.001)。在0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml TNF-α組中，隨著TNF-α濃度的增加，Cat K的表達(dá)水平升高(P<0.05)；100 ng/ml TNF-α組Cat K的表達(dá)水平低于10 ng/ml TNF-α組(P<0.05)。見表2及圖2。

表2 不同濃度TNF-α刺激24 h各組HUVEC中Cat K蛋白表達(dá)情況(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與10 ng/ml TNF-α組比較，#P<0.05；與1 ng/ml TNF-α組比較，▲P<0.05。

圖2 Cat K和β-actin在HUVEC表達(dá)的Western blot圖。

注：l為正常對照組；2為0.1 ng/ml TNF-α組；3為1 ng/ml TNF-α組；4為10 ng/ml TNF-α組；5為100 ng/ml TNF-α組。

2.3 不同時間TNF-α對HUVEC中Cat K mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)10 ng/ml TNF-α作用不同時間后，HUVEC中均可見Cat K mRNA表達(dá)，不同作用時間組的Cat K mRNA表達(dá)水平均高于正常對照組(F=91.576，P<0.001)。 在TNF-α 6 h、TNF-α 12 h、TNF-α 24 h組中，隨作用時間延長，Cat K mRNA的表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。TNF-α 48 h 組Cat K mRNA表達(dá)水平低于TNF-α 24 h組(P<0.05)。見表3及圖3。

表3 10 ng/ml TNF-α作用不同時間各組 HUVEC中Cat K mRNA 表達(dá)情況(x±s)

注：與對照組比較， *P<0.05；與TNF-α 24 h組比較，#P<0.05；與12 h TNF-α組比較，▲P<0.05。

圖3 Cat K和β-actin mRNA在HUVEC表達(dá)的電泳圖

注：l為對照組；2為TNF-α 6 h組；3為TNF-α12 h組；4為 TNF-α 24 h組；5為 TNF-α 48 h組。

2.4 不同時間TNF-α對HUVEC中Cat K蛋白表達(dá)的影響 正常對照組未見Cat K蛋白表達(dá)，予10 ng/ml TNF-α作用不同時間后，HUVEC可見Cat K蛋白表達(dá)，且表達(dá)水平均高于正常對照組(F=100.486，P<0.001)。在TNF-α 6 h、TNF-α 12 h、TNF-α 24 h組中，隨作用時間延長，Cat K蛋白的表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。TNF-α 48h組Cat K 蛋白表達(dá)水平低于TNF-α 24 h(P<0.05)。見表4及圖4。

表4 10 ng/ml TNF-α作用不同時間各組HUVEC中Cat K蛋白的表達(dá)情況(x±s)

注：與對照組比較， *P<0.05；與 TNF-α 24 h組比較，#P<0.05；與12 h TNF-α組比較，▲P<0.05。

圖4 Cat K和β-actin在HUVEC中表達(dá)的Western blot圖注：l為對照組；2為TNF-α 6 h組；3為TNF-α 12 h組；4為TNF-α 24 h組；5為TNF-α 48 h組。

3 討 論

Cat是在各種動物組織的細(xì)胞內(nèi)(特別是溶酶體部分)發(fā)現(xiàn)的一類蛋白酶，能在酸性環(huán)境中被活化的溶酶體蛋白酶，屬木瓜蛋白酶。人組織蛋白酶主要分為B、C、D、F、H、K、L、O、S、V 、W和X等12種亞型，大部分是半胱氨酸蛋白酶，其余是天冬氨酸或絲氨酸蛋白酶。Cat可降解不需要的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)或內(nèi)吞蛋白[7-9]。有研究證實，Cat K和Cat S是半胱氨酸蛋白酶超家族中的重要成員，能降解彈力纖維和Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原纖維，還參與生長因子、血管增殖調(diào)節(jié)及協(xié)助其他細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等，有助于細(xì)胞遷移、增殖及凋亡等的調(diào)節(jié)[8，10]。Cat K可以促進ECM的降解，與腹主動脈瘤形成密切相關(guān)[11-12]。

TNF是一類具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，它通過和細(xì)胞膜上的特異性的受體結(jié)合，實現(xiàn)促進細(xì)胞生長，分化，凋亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α 是一個多效的促炎癥因子，具有促進動脈粥樣硬化形成的特點。TNF-α由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)，可以調(diào)節(jié)其他炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。TNF-α可通過核轉(zhuǎn)錄因子κB和過氧化物酶體增生物激活受體-γ機制促進低密度脂蛋白跨HUVEC轉(zhuǎn)運，促進動脈粥樣硬化發(fā)生[13]。在大鼠頸動脈球囊損傷后，TNF-α抑制物苦參提取物能明顯減少損傷血管內(nèi)膜的TNF-α的表達(dá)及血管內(nèi)膜增生[14]；TNF-α抑制劑可能會抑制內(nèi)皮功能障礙的進展，減慢動脈粥樣硬進程[15]。正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞并沒有明顯Cat K表達(dá)，但是給予TNF-α等炎癥因子刺激后Cat K可以明顯表達(dá)。本研究結(jié)果也顯示，給予不同濃度TNF-α刺激24 h或10 ng/ml TNF-α作用不同時間后，均可見Cat K mRNA及蛋白的表達(dá)，表達(dá)強度均高于對照組(P均<0.05)，這與其他研究結(jié)果相似[6，16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血清Cat L、Cat K、Cat S是預(yù)測冠心病的有用標(biāo)志物，同時可作為阻滯心血管病相關(guān)蛋白降解的靶向藥物，炎癥因子和激素可調(diào)節(jié)培養(yǎng)心血管細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Cat的分泌和表達(dá)[17]。由于Cat ECM重構(gòu)的主要作用，已成為一些ECM相關(guān)的疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、癌癥和心血管疾病的重要的治療靶點[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激濃度為10 ng/ml作用時間為24 h時Cat K表達(dá)最強，而TNF-α刺激濃度為100 ng/ml或作用時間為48 h時Cat K mRNA和蛋白表達(dá)反而較前減少。提示TNF-α和其調(diào)控的多種炎癥介質(zhì)本身可能對細(xì)胞和組織造成損害。有研究發(fā)現(xiàn)，在40 ng/ml TNF-α作用24 h后HUVEC可見明顯細(xì)胞凋亡，異丙酚在臨床相關(guān)濃度范圍內(nèi)，可呈濃度梯度地減少TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡[19]。在急性心肌梗死中或心功能不全患者中，TNF、白細(xì)胞介素-8、C反應(yīng)蛋白、干擾素等多種炎癥因子釋放增多，可造成細(xì)胞和器官損害[20-21]。人血管內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠血管平滑肌細(xì)胞予一定濃度的TNF-α、IFN-γ、lL-1β培養(yǎng)超過24 h后，可以觀察到乳酸脫氫酶水平明顯增高，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞死亡增加[22-23]。因此TNF-α刺激濃度很大、作用時間很長時，有可能引起HUVEC損傷和死亡，從而使細(xì)胞Cat K表達(dá)減少，這與本次實驗結(jié)果相符。

綜上所述，在一定作用濃度及作用時間內(nèi)，TNF-α可以呈劑量和時間依賴性刺激HUVEC中Cat K表達(dá)，TNF-α可能通過促進Cat K的表達(dá)促進動脈硬化的發(fā)生。

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Effect of tumor necrosis factor-α on cathepsin K expression in human umbilical vein endothelial cells

ZHANGLiang1,ZHANGYi1,TANGQiu-hong2,LINChu-wei3,ZHOUSheng-hua4

(1DepartmentofCardiology,HunanProvincialPeople′sHospital,Changsha410005,China;2DepartmentofNephrology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China;3DepartmentofCardiology,ChangshaCentralHospital,Changsha410004,China;4DepartmentofCardiology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China)

Objective To observe the effect of tumor necrosis factor-α(TNF-α) with different concentrations and different actuation durations on the expression of cathepsin K(Cat K) in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).Methods HUVECs in logarithmic growth phase were used in the experiment.The HUVECs were divided into normal control group,0.1 ng/ml TNF-α group,1 ng/ml TNF-α group,10 ng/ml TNF-α group and 100 ng/ml TNF-α group treated with DMEM culture medium,0.1 ng/ml TNF-α,1ng/ml TNF-α,10 ng/ml TNF-α and 100 ng/m for 24 hours respectively.Other HUVECs were divided into control group,TNF-α 6 h group,TNF-α 12 h group,TNF-α 24 h group and TNF-α 48 h group.The control group was treated with DMEM culture medium for 24 hours,and the other groups were treated with 10 ng/ml TNF-α for the corresponding time.The expressions of Cat K mRNA and protein were detected in HUVECs of each group.Results The expression levels of Cat K mRNA and protein in the groups with different TNF-α concentrations increased compared to the normal control group(P<0.05).The expression levels of Cat K mRNA and protein increased in the order of 0.1 ng/ml TNF-α group,1 ng/ml TNF-α group and 10 ng/ml TNF-α group(P<0.05).The expression levels of Cat K mRNA and protein in 100 ng/ml TNF-α group were lower than those in 10 ng/ml TNF-α group(P<0.05).Compared to the control group,the expression levels of Cat K mRNA and protein in the groups treated with TNF-α for different times increased(P<0.05).The expression levels of Cat K mRNA and protein increased in the order of TNF-α 6 h group,TNF-α 12 h group and TNF-α 24 h group(P<0.05).The expression levels of Cat K mRNA and protein in TNF-α 48 h group were significantly lower than those in TNF-α 24 h group(P<0.05).Conclusion Within certain action concentration and actuation duration,TNF-α can stimulate the expression of Cat K in HUVEC in a time- and dose-dependent manner.TNF-α might promote the occurrence of arteriosclerosis by promoting Cat K expression.

Cathepsin K,Human umbilical vein endothelial cells,Tumor necrosis factor-α,Arteriosclerosis

張良(1979～)， 男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：介入心臟病學(xué)。

周勝華(1963～)，男，博士，教授，研究方向：介入心臟病學(xué)，E-mail：zhougqin@21cn.com。

R 543.3

A

0253-4304(2016)07-0901-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.02

2016-03-03

2016-05-27)