何愛麗　王夏曼

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科， 陜西 西安710004)

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·專家述評·

CAR-T細胞治療在血液腫瘤中的研究進展與問題

何愛麗王夏曼

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科， 陜西 西安710004)

免疫治療一直是腫瘤治療的熱點，隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展及人們對腫瘤發(fā)病機制的深入認識，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)過繼免疫療法得以在臨床試驗研究中開展。CAR-T治療難治復(fù)發(fā)急性淋巴細胞白血病、難治進展期淋巴瘤、難治復(fù)發(fā)慢性淋巴細胞白血病取得了突破性的進展，獲得了令人矚目的效果，但仍有部分患者維持時間短暫或?qū)χ委煙o反應(yīng)或發(fā)生嚴重的細胞因子釋放綜合征；對于多發(fā)性骨髓瘤、難治復(fù)發(fā)急性髓系白血病CAR-T療效還不滿意，在這些方面還存在許多挑戰(zhàn)及機遇，任重而道遠。本文就CAR-T細胞治療在血液腫瘤中的研究進展做一述評。

CAR-T; 細胞免疫治療; 血液腫瘤

執(zhí)行編委簡介：何愛麗，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師。現(xiàn)任陜西省康復(fù)醫(yī)學(xué)會副理事長、陜西省抗癌協(xié)會副理事長，陜西省醫(yī)學(xué)會副秘書長，陜西省臨床免疫學(xué)學(xué)會副主任委員、陜西省血液病學(xué)會常委，西安醫(yī)學(xué)會血液分會副主委，《西部醫(yī)學(xué)》雜志編委。2003年獲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二屆臺灣“新光獎教金”，2012年獲陜西省第九屆青年科技獎，國家青年科技獎候選人。主持國家自然科學(xué)基金2項，主持陜西省科技攻關(guān)項目6項，發(fā)表學(xué)術(shù)論文近百篇，其中SCI收錄論文20余篇，合編著作2部。獲陜西省科技成果獎二等獎1項，陜西省教育廳科技成果一等獎1項，國家實用新型專利1項。多次獲西安交通大學(xué)教師授課競賽二、三等獎。E-mail：heaili@mail.xjtu.edu.cn

隨著基因重組技術(shù)、免疫療法的不斷進展和人們對于機體免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用的深入認識，近年來細胞免疫療法在臨床上的應(yīng)用取得了許多突破性的進展，為惡性疾病的治療帶來了新的方向。免疫療法包括腫瘤疫苗、溶瘤病毒、T細胞或NK細胞、嵌合抗原受體T細胞(Chimeric antigen receptor T，CAR-T)過繼免疫療法等。研究者在探索細胞免疫治療的道路上也進行了諸多的嘗試。淋巴因子激活的殺傷(Lymphokine-activatedkiller，LAK)細胞、LAK-樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)、DC-細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(Cytokine-induced killer，CIK)作為腫瘤的免疫治療手段，并未取得預(yù)期的滿意療效，可能是由于其缺乏特異性識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associatedantigen， TAA)和殺傷特定腫瘤靶細胞的能力，而嵌合抗原受體T細胞在惡性腫瘤尤其是在血液惡性腫瘤治療中取得了富有前景性的療效，并在全世界開展臨床研究,有可能成為最有希望治愈血液惡性疾病的方法之一。

1　CAR-T細胞簡介

隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，可以在T細胞表面穩(wěn)定地表達特定抗體，使其具有特異性抗原表位。嵌合抗原受體T細胞免疫療法即是在此基礎(chǔ)上開展的一項細胞免疫療法。該嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CARs)是由胞外的特定抗體構(gòu)成的抗原識別結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)的CD3-ζ鏈或FcγRI蛋白經(jīng)跨膜區(qū)連接組成的抗原嵌合蛋白[1]。在該CARs受到特異性抗原識別并激發(fā)后可為T細胞提供活化信號并通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域傳導(dǎo)該信號，引起細胞的活化，表現(xiàn)為CARs依賴的細胞活化及細胞殺傷作用并有細胞因子的大量釋放[2]。為了增加CARs細胞的殺傷作用，通過在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建與胞外的CD3Cζ相連的共刺激分子結(jié)構(gòu)來達到信號傳遞作用的擴增，使細胞殺傷作用得到成倍的擴大，極大地提高了CARs細胞的殺傷作用[3]。一代CARs胞內(nèi)僅含一個活化結(jié)構(gòu)域，因此其在特異性識別腫瘤細胞相關(guān)抗原后的殺傷作用十分有限[4]。二代CARs含有一個活化結(jié)構(gòu)域和一個共刺激區(qū)域，比如：CD28 或 4-1BB[5-6]。三代CARs胞內(nèi)部分則由活化結(jié)構(gòu)域和多重共刺激區(qū)域組成，如：CD27, CD28, 4-1BB 和 OX40等，這些結(jié)構(gòu)域的增加不但能夠增加CAR-T細胞特異性識別TAA及結(jié)合等能力，更能夠顯著擴大由胞外區(qū)傳遞的細胞信號，引起下級細胞殺傷作用的級聯(lián)增大[7]。隨著CARs結(jié)構(gòu)設(shè)計的完善和其針對不同的腫瘤靶向識別和殺傷作用的提高，研究者們還構(gòu)建了許多其他的胞內(nèi)的共刺激分子結(jié)構(gòu)，包括： CD134, Lck, ICOS和 DAP10等[8]。此外，來自美國杜克大學(xué)免疫研究中心的實驗人員對CD19-的CAR-T細胞進行了進一步的改造，使其可以自分泌IL-12，在特定的同基因腫瘤模型中，可以減少甚至可能不需要預(yù)處理化療，若進一步推廣至臨床則可使患者在更低的毒副作用下獲得更好的療效[9]。因此，CARs相關(guān)技術(shù)的不斷革新不僅僅是結(jié)構(gòu)上的優(yōu)化，更是功能上的更多共刺激分子區(qū)域的構(gòu)建，CAR-T細胞的效率和作用也將獲得進一步的提高。

2　CAR-T細胞在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療研究

CAR-T細胞免疫治療在許多腫瘤的臨床應(yīng)用中都取得了較滿意的效果，如針對腎癌的程序性死亡受體1((Programmed death 1，PD-1)和針對乳腺癌的人類表皮生長因子受體((Human epidermal growth factor receptor-2,HER2)的CAR-T細胞均在臨床試驗中表現(xiàn)出了令人鼓舞的療效[10-11]。不同于實體腫瘤，血液惡性腫瘤具有高侵襲性和預(yù)后不良等特征，長期以來治療效果并不滿意，隨著對疾病認識的深入，越來越多靶向藥物和免疫治療手段的應(yīng)用為這些疾病的治療帶來一線曙光，尤其是CAR-T細胞免疫治療近年來取得了令人矚目的結(jié)果。

2.1難治進展期淋巴瘤血液細胞及異常的血液腫瘤細胞表面均具有特征性的抗原表位，并已在臨床中用于診斷疾病、判斷預(yù)后及監(jiān)測治療效果的指標。CD19即是一種限制性表達于正常成熟B系、惡性B細胞、前體B細胞及漿細胞系的細胞膜表面蛋白[12-13]。2010年，Kochenderfer[14]等報道了1例應(yīng)用CD19修飾的CAR-T細胞治療難治進展期淋巴瘤患者，有效地遏制了疾病的進展。自此，CAR-T細胞免疫療法在血液惡性腫瘤治療中的意義引起了人們廣泛的關(guān)注，并被《Science》雜志評為2013年十大科學(xué)突破之首。第57屆美國血液年會報道了CD19-CAR-T治療38例復(fù)發(fā)難治NHL，包括21例彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，14例濾泡性淋巴瘤(FL)，3例套細胞淋巴瘤(MCL)，治療3月后可評估病例22例，總反應(yīng)率為68%(15/22)；DLBCL、FL、MCL的反應(yīng)率分別為54%(7/13)、100(7/7)、50%(1/2)[11]。另外一項臨床研究報道了CD19-CAR-T治療6例難治侵襲性NHL，3例可評估患者中2例完全緩解(Completeremission,CR)，1例部分緩解(Partremission,PR)。一項使用CD19修飾的CART細胞治療HSCT后B細胞NHL患者的臨床研究中，接受1代及2代CAR-T細胞治療的患者分別有50%及75%獲得了較長時間的疾病無進展期，并表現(xiàn)出較好的安全性[15]。在難治彌漫大B細胞淋巴瘤(DCLBL)及惰性B細胞淋巴瘤患者中應(yīng)用CD19修飾的CAR-T細胞治療也取得了較好的效果，在總共接受治療的15名(9例DLBCL、4例CLL、2例孤立淋巴瘤)患者中8名獲得CR，4名獲得PR，并且在獲得CR的4名DLBCL患者中，3名患者在觀察過程(9-22月)中一直持續(xù)完全緩解[16]。

2.2急性淋巴細胞白血病2013年，應(yīng)用二代的CD19修飾的CAR-T細胞治療5名持續(xù)性形態(tài)學(xué)或微小殘留病變(Minimal residual disease，MRD)陽性復(fù)發(fā)的B系急性淋巴細胞白血病(B-ALL)患者。CAR-T細胞輸注后腫瘤細胞均被清除且顯示MRD(-)獲得了完全緩解。其中4例病人隨后接受了同種異體造血干細胞移植。在輸注后的3-8周在這些病人的外周血或骨髓中均可檢測到CAR-T細胞的存在。另外一例，未接受后續(xù)同種異體干細胞移植及T細胞治療，并且這例患者曾因細胞因子毒性反應(yīng)接受過類固醇類激素的治療。盡管如此，該患者仍獲得了長達90天的疾病持續(xù)緩解期[17]。隨后，該課題組繼續(xù)應(yīng)用CAR-T療法對另外11例難治復(fù)發(fā)的B-ALL患者進行治療。以上16例患者中4例為Ph+ALL，4例為移植后復(fù)發(fā)患者，因此CAR-T治療對于他們來說均為挽救性治療手段，但結(jié)果使14/16(88%)患者獲得了完全緩解。并且7例病人隨后接受了異體造血干細胞移植，且在后續(xù)2～24個月的隨訪中無患者復(fù)發(fā)。在4例之前接受過造血干細胞移植的病人并未出現(xiàn)CAR-T細胞相關(guān)的移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)[18]。2014年，Carl June等報道CAR-T對30例復(fù)發(fā)性/難治性B細胞ALL患者(25例為兒童)有顯著療效。這些患者中，有27例(90%)達到完全緩解，多數(shù)為持續(xù)性(24個月)。6個月無事件生存率達67%，而總生存率為78%[19]。2015年底，《柳葉刀》雜志發(fā)表了應(yīng)用CD19抗原修飾的CAR-T細胞治療21例兒童或青年(<30歲)急淋/非霍奇金淋巴瘤的臨床試驗報告，在接受由氟達拉濱和環(huán)磷酰胺組成的預(yù)處理方案后接受CD19-CAR-T細胞輸注。14名患者獲得了完全緩解，并且其中10名隨后接受了造血干細胞移植從而獲得了持續(xù)緩解，2名評估后不適合接受移植的病人也獲得了持續(xù)的MRD(-)緩解，6名輸注后無反應(yīng)的患者中的其中3名又接受了第二次治療，依然無效[20]。第57屆美國血液年會報道CD19-CAR-T治療復(fù)發(fā)難治ALL，完全緩解率為94%(50/53),3例無反應(yīng)。Brudno[21]等報告應(yīng)用異基因造血干細胞移植失敗的供者異基因CAR-T治療20例B細胞惡性腫瘤(5例ALL、5例CLL、5例MCL、5例DLBCL),8例有效，所有患者均未發(fā)生GVHD，其中5例ALL中4例達CR,1例PR。以上研究可以看出，針對CD19抗原的CAR-T細胞在B-ALL治療中取得了令人滿意的療效，臨床檢測及研究也顯示其在患者體內(nèi)具有擴增及持續(xù)性殺傷腫瘤細胞的作用，可使復(fù)發(fā)難治的B系急性白血病患者獲得持續(xù)緩解[22]，但也有部分患者體內(nèi)CAR-T細胞持續(xù)時間短或無反應(yīng)，因此后續(xù)還需要對現(xiàn)有的CAR-T進行改進。一項動物實驗應(yīng)用CD4+-CAR-T治療前B淋巴細胞白血病，其與CD8+-CAR-T有同樣的清除白血病細胞的作用，而且持續(xù)時間更長[23]。

2.3多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)性骨髓瘤作為B系腫瘤由于并不常規(guī)表達CD19[24, 25]，并不被認為是一個有效的多發(fā)性骨髓瘤免疫治療靶點。但是，既往有報道顯示部分耐藥及侵襲性高的多發(fā)性骨髓瘤細胞具有B細胞(CD19-)表型[26]。因此，Alfred等[27]報道對1例難治性多發(fā)性骨髓瘤患者進行CTL019細胞輸注聯(lián)合標準治療(大劑量馬法蘭+自體干細胞輸注)的臨床試驗。接受治療后該患者血清單克隆IgA及總IgA在移植及輸CTL019后均下降，腫瘤負荷降低了105倍，且MRD在移植后100天(輸CTL019后87天)后持續(xù)陰性，提示CTL019細胞的輸注可使疾病獲得持續(xù)性及穩(wěn)固性緩解。隨后此課題組發(fā)表了10例接受CTL019細胞治療的多發(fā)性骨髓瘤患者，其中6例獲得持續(xù)緩解，1例發(fā)生CTL019相關(guān)細胞因子毒性，1例發(fā)生GVHD相關(guān)小腸炎。此病例給我們帶來啟發(fā)，盡管某些血液腫瘤細胞表面表達特異性抗原的頻率并不高，但是將針對特定抗原的CAR-T細胞免疫治療與非特異性治療及自體骨髓移植等治療手段結(jié)合，可能對于難治的疾病終末期患者也有令人滿意的療效。尋找特異性的抗原也是CAR-T細胞治療的關(guān)鍵，第57屆美國血液年會上報道了3例漿細胞白血病及4例難治復(fù)發(fā)MM患者應(yīng)用輸注供者來源的WT1特異性的細胞毒性 T 細胞，4例患者接受異基因干細胞移植，隨后接受細胞治療，2例持續(xù)緩解達2年[28]。一項在MM患者及AML患者中的研究顯示，Lewis Y抗原已被證實其表達于大部分的MM細胞表面，而該抗原修飾的CAR細胞的抗AML細胞作用已在體外證實，但對于MM細胞的作用尚未得到驗證。其他針對BCMA、CD138及Kappa 輕鏈抗原的CAR細胞免疫療法治療MM的臨床試驗也正在進行中[29-32]。

2.4慢性淋巴細胞白血病2011年，首次報道1例應(yīng)用CD19修飾的CAR-T細胞治難治慢性淋巴細胞白血病患者，使該患者獲得了完全緩解且體內(nèi)CD19+淋巴細胞的持續(xù)陰性，有效遏制了疾病進展[33]。2013年有研究者將CD19修飾的供者淋巴細胞輸注于接受異基因造血干細胞移植術(shù)后的10例難治CLL患者，其中5例獲得了完全緩解，1例獲得了部分緩解，為移植后復(fù)發(fā)的CLL患者治療帶來了新的思路[34]。且在輸注時同時使用依魯替尼也可提高CLL患者體內(nèi)CAR-T細胞的植入成活率并增強其靶向殺傷的作用[35]。

2.5難治性急性髓系白血病(AML)及骨髓增生異常綜合征(MDS)WT1表達于大部分的AML及MDS細胞上，mWT1已經(jīng)作為微小殘留病變指標監(jiān)測疾病的狀態(tài)，針對WT1特異性TCR的T細胞輸注后應(yīng)用WT1疫苗治療難治性的不適合骨髓移植的平均69歲的AML(1例)及MDS(4例)患者，2例患者出現(xiàn)外周血異常紅系細胞及骨髓中原始細胞的減少，此試驗還在進行中[36]。此外，在體外實驗中具有PR1/HLA-A2抗原表位修飾的CAR-T細胞也具有殺傷AML細胞的作用[37]。但CAR免疫療法在AML治療中的療效目前還達不到ALL的療效，任重而道遠。

3　不良反應(yīng)及處理

盡管CAR-T細胞治療取得了令人驚喜的臨床試驗結(jié)果，但不得不承認細胞治療過程中仍存在許多風(fēng)險，輸注后的不良反應(yīng)為治療帶來很大考驗。由于CAR-T在體內(nèi)可增殖并對靶細胞產(chǎn)生嚴重的細胞毒性作用，其中最常見和嚴重的即是細胞因子釋放綜合征(Cytokine release syndrome，CRS)[38]。在目前報道的CAR-T細胞治療血液腫瘤的病例中，幾乎均出現(xiàn)了不同嚴重程度的CRS反應(yīng)。CRS主要是由于細胞被大量激活后循環(huán)中包括IL-6、鐵蛋白、INFγ、IL-2, 粒細胞集落刺激因子(GM-CSF), IL-10, IL-8, IL-5在內(nèi)的細胞因子迅速升高所引起的以無感染原因的發(fā)熱、持續(xù)性低血壓、甚至有報道出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)毒性如癲癇發(fā)作等[39, 40]。有研究對接受CD19修飾的CAR-T細胞治療的51名患者中48名患者(94%)發(fā)生了CRS，且所有發(fā)生4～5級嚴重CRS的患者血清鐵蛋白水平均>10000mg/dl，C反應(yīng)蛋白的升高情況與病程的關(guān)系也與鐵蛋白類似，但血清中C-反應(yīng)蛋白及鐵蛋白水平對于CRS的進展的預(yù)測并沒有明顯作用。進一步他們以10名健康志愿者作為基線，發(fā)現(xiàn)在接受CAR-T細胞治療后1個月內(nèi)的嚴重CRS反應(yīng)與包括IFNγ, IL6, sgp130, 和 sIL6R 在內(nèi)的24種細胞因子在血清中的峰值水平相關(guān)[41]。嚴重的CRS反應(yīng)患者對患者的生存造成了巨大風(fēng)險，患者出現(xiàn)嚴重的低血壓甚至休克、呼吸窘迫綜合癥、神經(jīng)毒性、肝腎功能不全，因此必須積極處理上述情況。除了應(yīng)用血管活性藥物、氣管切開及加強支持治療等，針對IL-6受體的抑制劑妥珠單抗的應(yīng)用十分必要，它通過抑制IL-6結(jié)合于細胞上及可溶性的IL-6受體而阻斷其經(jīng)典及旁路LI-6信號通路，因此在接受該單抗治療后許多患者迅速取得了良好的臨床反應(yīng)[42]。CRS可以分為5級，不同的級別建議的CRS治療手段不同，一般建議優(yōu)先早期足量使用妥珠單抗預(yù)防嚴重CRS反應(yīng)，但由于IL-6單抗并不容易通過血腦屏障，在出現(xiàn)3～4級神經(jīng)毒性患者中，可優(yōu)先使用糖皮質(zhì)激素預(yù)防嚴重CRS。因此，IL-6單抗可以相對早期應(yīng)用，對于CRS均可控制且并不影響CAR-T的療效。

4　小結(jié)與展望

目前CAR-T細胞治療在臨床上的應(yīng)用尤其是CD19的CAR-T在血液腫瘤中的治療取得了極大的成果，而且以CAR-T細胞免疫治療為代表的過繼免疫療法的應(yīng)用潛力是無限的。不僅是在血液病中，在實體腫瘤乃至許多良性或慢性疾病中，它也可能具有廣闊的應(yīng)用前景[43]。隨著基因重組技術(shù)及抗原蛋白構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展，更多具有精準靶向的CAR-T也將成為可能。此外，在不同血液腫瘤細胞表面表達的抗原表位，如:CD22、CD20、CD34等也可能作為未來治療其他難治血液疾病的靶向，為疾病的治療帶來新的方向[44, 45]。不僅僅是針對腫瘤細胞表面的抗原表位，以腫瘤形成的關(guān)鍵通路，如：PI3K/AKT、JAK/STAT等通路的特定抗原，乃至腫瘤微環(huán)境中對于腫瘤細胞耐藥相關(guān)分子為靶點的治療也可能顯著提高目前治療腫瘤的效率或?qū)⑸鲜鐾返募っ敢种苿┡cCAR-T細胞免疫療法結(jié)合起來，也可作為未來腫瘤治療的方向。但在既往報道中仍存在少數(shù)病人對CAR-T細胞治療無效，可能是體內(nèi)存在免疫逃逸機制或免疫清除等，使靶向的治療細胞無法產(chǎn)生預(yù)期的殺傷效果[46]。一項將CD19修飾的CAR-T細胞用于MLL重排的B細胞急淋患者治療中發(fā)現(xiàn)，2名患者在接受治療后1月后發(fā)展為AML，可能與該患者體內(nèi)CD19陰性細胞的免疫逃逸的某種機制相關(guān)[47]。因此聯(lián)合多種抗原表位的靶向CAR-T治療的應(yīng)用以及CAR-T細胞的在體內(nèi)持續(xù)殺傷作用也可能為這些目前治療無效的病例帶來新的希望。針對AML等應(yīng)用檢查點抑制劑聯(lián)合CAR-T治療動物實驗上也取得了進展[48]。但由于CAR-T細胞治療仍存在較明顯的臨床不良反應(yīng)帶來較大的治療風(fēng)險，因此，CAR-T療法的安全性和毒副反應(yīng)的避免也是亟待解決的一項臨床問題。

目前，將針對特異性抗原表位的CAR-T細胞治療與非特異性針對腫瘤細胞的傳統(tǒng)療法結(jié)合起來也是治療此類疾病較為安全合理的方案，不僅可以全面殺傷腫瘤細胞，減少免疫逃逸及無效的可能性，并且CAR-T細胞免疫治療也反過來減低既往化療等非靶向治療的劑量及由此所引起的毒性反應(yīng)，因此，在不斷發(fā)現(xiàn)新的靶向抗原構(gòu)建精準免疫治療的同時，與非靶向藥物及造血干細胞移植治療的結(jié)合也是目前及相當長一段時間內(nèi)CAR-T細胞治療的研究方向。由此，CAR-T細胞治療為難治血液惡性腫瘤患者帶來了新的希望，盡管目前已取得令人欣喜的治療效果，但仍需要更多研究和更進一步臨床試驗的經(jīng)驗積累，通過多層次多角度，聯(lián)合既往及新近靶向治療的經(jīng)驗，會給CAR-T細胞治療帶來更廣闊的應(yīng)用前景和令人振奮的臨床療效。

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Progress of chimeric antigen receptor T cell immunotherapy in hematologic malignancies

HE Aili,WANG Xiaman

(DepartmentofHematology,TheSecondAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

Since the breakthrough made in gene recombination technique and deeper understanding on mechanism of tumorigenesis，immunotherapy has moved into the mainstream of oncology treatment. Chimeric antigen receptor (CAR) T cell adoptive immunotherapy has become a promising therapy for cancer. Early clinical trials using CAR T cells for the treatment of patients with refractory hematological malignancies achieved promising efficacy. Despite these wonderful clinical outcome, there still exist many patients could’d get continuous remission or show no response to CAR-T therapy and responses among patients with multiple myeloma or refractory and relapsed acute myeloid leukemia haven’t win great satisfaction. Additionally, cytokine release syndrome is the most significant and life-threatening toxicity which needs more clinical experiences. All above may guide new challenges and important discoveries in immunotherapy of hematological malignancies.

Chimeric antigen receptor T Cell immunotherapy; Hematological malignancy

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2014TCL 03-02)

R 733.7

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.001

2016-06-01； 編輯： 陳舟貴)