邵闖綜述，薛建江審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院檢驗科，重慶401331）

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制的研究進展

邵闖綜述，薛建江△審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院檢驗科，重慶401331）

克雷伯菌，肺炎；青霉屬；碳；抗菌藥；藥物耐受性；耐藥機制；綜述

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一類常見的、重要的革蘭陰性桿菌，主要存在于人體的上呼吸道和腸道中，當機體免疫力低下或長期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時容易引起感染，或者通過患者之間、醫(yī)護人員與患者間的接觸及醫(yī)療用具傳播，引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多部位的感染。肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內(nèi)感染尤其是呼吸道感染的常見條件致病菌之一，近年來已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌，也是臨床上常見的耐藥菌之一［1］。本文主要對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的耐藥機制進行綜述。

1　肺炎克雷伯菌的耐藥現(xiàn)狀

隨著廣譜抗生素的應(yīng)用，特別是第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛、大量應(yīng)用，引起的醫(yī)院內(nèi)感染及耐藥日趨嚴重，臨床分離的肺炎克雷伯菌對三代頭孢菌素耐藥，即產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBLs）陽性率已接近50%，而且其耐藥速度正逐年增加。β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前應(yīng)用最廣泛、最普通的抗菌藥，對細菌感染的治療起著重要作用，但其耐藥菌株的出現(xiàn)也給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)和困難。自1983年德國報道首例產(chǎn)ESBLs菌株以來，該菌的流行在世界各地已有廣泛報道，在短短二十幾年中，產(chǎn)ESBLs菌株的分離率急劇增加，其種類已超過200種。

碳青霉烯類抗生素是一類抗菌譜廣、抗菌活性強的非典型β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，具有對β-內(nèi)酰胺酶作用穩(wěn)定及毒性低等特點；其次，碳青霉烯類抗生素對細菌的靶體蛋白、青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）有良好的選擇性，而且和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎無交叉耐藥性。因此，碳青霉烯類抗生素已成為產(chǎn)ESBLs和（或）頭孢菌素酶（AmpC酶）的多重耐藥腸桿菌科細菌感染最有效的抗菌藥物，首選于治療多重耐藥菌所致醫(yī)院內(nèi)感染，構(gòu)筑了抗β-內(nèi)酰胺酶的最后一道屏障。但是，由于近年來碳青霉烯類抗生素在臨床上的大量不合理使用，加速了臨床上腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的產(chǎn)生并呈現(xiàn)快速上升趨勢，特別是肺炎克雷伯菌尤為明顯，即CRKP的出現(xiàn)和傳播給臨床醫(yī)生帶來了巨大挑戰(zhàn)［2］。2013年，CRKP的發(fā)生率已達4.3%［3］，而且還在世界范圍內(nèi)引起了暴發(fā)流行［4］。

CRKP引起的感染在臨床上不但呈增加趨勢，而且其耐藥性還通過質(zhì)粒在細菌間傳遞，不斷蔓延、變遷，因此，其耐藥問題不容忽視，及早發(fā)現(xiàn)并監(jiān)控CRKP定植或感染，研究其耐藥機制的發(fā)生與發(fā)展，對控制細菌耐藥性的發(fā)生和傳播至關(guān)重要。有研究表明，CRKP感染者或無癥狀攜帶者均為潛在的感染源［5］。因此，對無癥狀CRKP攜帶者進行積極篩查、隔離，可控制CRKP的播散［6］。

2　CRKP的耐藥機制

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制主要有以下幾個方面：（1）產(chǎn)生碳青霉烯酶，可以水解碳青霉烯類抗生素，是其耐藥的重要機制之一［7］；（2）高水平產(chǎn)AmpC酶或ESBLs合并外膜孔蛋白（outer membrane proteins，OMP）缺失或表達量下降；（3）碳青霉烯類高親和位點PBPs的數(shù)量下降，對碳青霉烯類抗生素的親和力下降；（4）主動外排泵系統(tǒng)增強，外排量增多等。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生是最主要的機制［8］。

2．1碳青霉烯酶Ambler分類法根據(jù)氨基酸序列的相似程度，將β-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D 4類，其中A、B、D類中具有能夠水解碳青霉烯活性的酶（即碳青霉烯酶），是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥的最主要機制。

2.1.1A類碳青霉烯酶A類酶因含有絲氨酸殘基又被稱為絲氨酸酶，目前包括產(chǎn)KPC、SME、IMI、NMC和GES 5種，以產(chǎn)KPC類酶最為常見，各種酶及同一種酶的不同類型對碳青霉烯類的水解活性均有很大差異。

產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的最主要機制。1997年在美國北卡羅來納州發(fā)現(xiàn)了第1珠耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌［9］，其可以產(chǎn)KPC-1酶。目前在肺炎克雷伯菌中已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)KPC酶有11種類型（KPC 1～11），在國內(nèi)臨床分離的肺炎克雷伯菌中以產(chǎn)KPC-2最為常見［10］，而國外以產(chǎn)KPC-3的檢出率較高［11］。自我國2007年發(fā)現(xiàn)第1例產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌以來［12］，對碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌的檢出率呈上升趨勢，給臨床治療帶來更多困難。

2.1.2B類碳青霉烯酶B類酶又稱作金屬β-內(nèi)酰胺酶，每個酶中均含有至少1個鋅離子活性中心，可以水解碳青霉烯類帶有β-內(nèi)酰胺環(huán)的多種抗生素，其水解活性不能被克拉維酸和舒巴坦等所抑制，但可以被乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等螯合劑所抑制。目前從肺炎克雷伯菌中檢出的B類碳青霉烯酶主要有IMP、VIM和NDM-1等類型［13］。

IMP酶對碳青霉烯類抗生素的水解能力較弱，通常僅攜帶IMP基因的肺炎克雷伯菌不能對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥。往往在合并了OMP缺失、主動外排泵系統(tǒng)增強等其他耐藥機制時，才會對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生高度耐藥［14］。目前，IMP酶共有30多個類型，不同國家的流行菌株不具有同源性［15］，主要通過Ⅰ類整合子傳播，我國主要以IMP-4和IMP-8較為常見。VIM是金屬酶中對碳青霉烯類水解能力較強的一種，目前已報道的類型有30多種，其中以VIM-1最為常見。2003年希臘報道了第1例產(chǎn)VIM-1酶的肺炎克雷伯菌，自此以后其他類型的VIM也相繼被檢測出來［16］。產(chǎn)VIM-1酶的菌株對頭孢菌素類、碳青霉烯類抗生素的敏感性顯著下降。VIM基因通過Ⅰ類整合子進行傳播，流行范圍廣，有明顯的地域性。NDM-1是在2009年報道的從肺炎克雷伯菌中分離出的新的金屬酶基因型，該菌株對幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥［16］，僅對替加環(huán)素敏感。隨后，攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯菌在很多國家都有報道，其中在亞洲地區(qū)較為常見。雖然目前我國分離出該菌的報道并不多見，但還是應(yīng)提高警惕，避免引起大范圍的流行。

2.1.3D類碳青霉烯酶D類酶又稱作苯唑西林酶（OXA酶），酶動力學(xué)研究顯示，該類酶的底物譜狹窄，不能水解廣譜頭孢菌素和氨曲南，對亞胺培南的親和力較高，但水解效能較低，其耐藥性表現(xiàn)有賴于膜通透性降低等其他耐藥機制的協(xié)同作用，不能被克拉維酸、他唑巴坦等酶抑制劑抑制［17］。目前報道的OXA酶有200多種，在肺炎克雷伯菌中主要是OXA-48。雖然OXA酶的亞類報道并不多，但其突變的新類型出現(xiàn)速度很快，需要引起一定的重視。

2.2高水平產(chǎn)AmpC酶或ESBLs合并OMP缺失或表達量下降

2.2.1AmpC酶質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶是由腸桿菌屬及假單胞菌屬等染色體上的AmpC基因通過基因轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒上，是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的又一種重要的酶，該酶使肺炎克雷伯菌能夠?qū)︻^孢他啶等三代頭孢菌素類藥物耐藥，且不能被克拉維酸所抑制。自1988年發(fā)現(xiàn)首例質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶MRI-1以來，已發(fā)現(xiàn)40余種基因型，主要有ACC、ACT、CMY、DHA等。目前全球流行最多的AmpC酶基因型為CMY-2，主要分布在美國、加拿大和歐洲［18］，我國以DHA-1基因型為主［19］。由于為質(zhì)粒介導(dǎo)，其具有較快的傳播速度和較強的耐藥性，因而導(dǎo)致廣泛傳播，成為臨床抗感染治療的棘手問題。

2.2.2ESBLsESBLs為質(zhì)粒編碼的β-內(nèi)酰胺酶，是絲氨酸蛋白衍生物，通過水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類而導(dǎo)致該類藥物耐藥，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸鉀所抑制。目前在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的ESBLs主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA、VEB、GES等，其中SHV最為常見［20］。TEM與SHV主要對青霉素、氨芐西林及頭孢他啶等一代頭孢菌素耐藥。在我國主要以CTX-M型最常見。目前用于治療產(chǎn)ESBLs菌所致感染的藥物主要是碳青霉烯類，其中亞胺培南具有高效、超廣譜的抗菌活性，是治療ESBLs菌引起感染的首選藥物。

2.2.3OMP缺失或表達下降革蘭陰性菌細胞外膜是由許多微孔蛋白組成的孔道，是一種非特異的、能夠跨越細胞膜的水溶性擴散通道，一些藥物可經(jīng)通道進入細菌內(nèi)而發(fā)揮作用。大多數(shù)抗生素發(fā)揮活性抗菌的決定因素不單單取決于外膜的通透性或抗生作用的失活，而是取決于二者之間的平衡。如果OMP缺失或表達下降，抗菌藥物則難以進入細胞內(nèi)或滲入速度減慢，使抗菌藥物在滲入過程中被滅活而產(chǎn)生耐藥性。肺炎克雷伯菌的孔道蛋白主要有OmpK35、OmpK36和OmpK37，其中Ompk35是細菌發(fā)生耐藥最主要的膜孔蛋白，OmpK37一般情況下不表達或表達量極少，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳無法檢測到。Yang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，OMP缺失這一單一因素并不能引起肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥，僅能使其對碳青霉烯類藥物的耐藥性增加，只有當合并了其他耐藥機制時才能表現(xiàn)出對其耐藥，其中最為常見的機制為高水平產(chǎn)ESBLs或AmpC酶。

2.3PBPsPBPs是細菌細胞膜上的一種蛋白質(zhì)，因其可與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合而得名。1972年Suginaka等第一次報道了PBPs，他們用放射性同位素標記的方法找到了細菌表面的PBPs［22］。絕大部分細菌都含有PBPs，但不同的細菌所含有的數(shù)量、相對分子質(zhì)量及對β-內(nèi)酰胺類藥物的親和力不同。它的正常存在是維持細菌形態(tài)及功能正常的必要條件，青霉素等正是通過與其結(jié)合而抑制細菌細胞壁的生物合成導(dǎo)致細菌死亡，從而起到殺菌作用。PBPs靶蛋白與抗生素的親和力降低、數(shù)量增多或減少及產(chǎn)生新的PBPs均可使抗生素的抗菌作用降低，從而導(dǎo)致耐藥。

2.4主動外排泵系統(tǒng)增強主動外排系統(tǒng)是指在肺炎克雷伯菌內(nèi)膜上的一種蛋白外排泵，它可以通過能量的消耗將進入細菌內(nèi)的抗菌藥物不斷的排出細菌外，使其不能發(fā)揮抑菌作用［23］。該系統(tǒng)主要由周質(zhì)融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運子AcrB組成（即AcrAB-TolC系統(tǒng)）。AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)是肺炎克雷伯菌最主要的多重藥物外排系統(tǒng)。主動外排泵系統(tǒng)的作用是非專一性的，可以主動排除包括內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等藥物，通常在同一種菌中存在多種主動外排系統(tǒng)，可以導(dǎo)致該細菌對各種結(jié)構(gòu)不同的藥物產(chǎn)生耐藥，也是使該細菌產(chǎn)生多重耐藥的一個機制。有報道指出，主動外排泵系統(tǒng)產(chǎn)生的耐藥與該藥物對致病菌的膜的通透性相關(guān)，當外排系統(tǒng)表達活躍時，細菌對抗菌藥物外排系統(tǒng)的外排速度大于其進入細菌內(nèi)的速度，或者該系統(tǒng)的外排作用使能夠進入細菌內(nèi)發(fā)揮抗菌作用的藥物極度減少，從而產(chǎn)生耐藥；相反，對那些通透性較好的抗菌藥，若外排系統(tǒng)的排出速度不足以克服藥物內(nèi)流的速度，則對該藥物仍表現(xiàn)出敏感。

2.5整合子整合子是存在于細菌質(zhì)粒和（或）染色體上的遺傳單位，具有基因捕獲和表達功能，即是一種天然的克隆和表達系統(tǒng)［22］。1989年Hall首先發(fā)現(xiàn)并提出整合子概念，可以在一定條件下被識別和捕獲，是攜帶編碼抗菌藥物耐藥基因盒的DNA片段［26］。研究表明，整合子不僅能通過介導(dǎo)細菌耐藥性群聚而產(chǎn)生多重耐藥性，而且可以在不同菌種和不同遺傳物質(zhì)間轉(zhuǎn)移，引起耐藥基因快速廣泛傳播［24］。因此，整合子系統(tǒng)介導(dǎo)的細菌耐藥性機制引起越來越多研究人員的關(guān)注，尤其是針對多重耐藥的研究。整合子根據(jù)intⅠ基因序列的不同進行分類，迄今發(fā)現(xiàn)的含有抗生素耐藥基因盒的整合子有5類，而肺炎克雷伯菌中主要含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。其中Ⅰ類整合子是最早被發(fā)現(xiàn)也是最為常見的，從臨床分離菌株中發(fā)現(xiàn)的整合子大多數(shù)屬于Ⅰ類。Ⅰ類整合子中含有肺炎克雷伯菌大部分的耐藥基因，其在產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中普遍存在，也是造成多重耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行的主要原因。

3　小結(jié)與展望

近年來，隨著肺炎克雷伯菌引起的感染率明顯增加，大量廣譜抗生素的應(yīng)用導(dǎo)致臨床分離的肺炎克雷伯菌耐藥情況日趨嚴重，有些細菌甚至呈多重或廣泛耐藥。目前出現(xiàn)的對包括碳青霉烯在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的細菌，在臨床抗感染治療中呈現(xiàn)出無藥可治的情況，成為棘手的問題［25］。因此，通過肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制的研究，盡早采取措施降低患者的感染率和患病率，為醫(yī)院內(nèi)感染的防控提供依據(jù)，對合理指導(dǎo)臨床治療和多重耐藥細菌的篩查、發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控具有重要意義。未來應(yīng)基于對其耐藥機制的更深入研究，研制出合理、有效的新型抗菌藥，以提高抗感染的成功率。

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2016-05-30）