王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌及其在獸醫(yī)領域的應用研究進展

王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，是一種寶貴的微生態(tài)資源，在人醫(yī)領域已經(jīng)得到廣泛應用，但獸醫(yī)臨床應用還處在初步探索階段。本文詳細描述了草分枝桿菌的生物學和免疫學特性，并對其在獸醫(yī)領域的應用進行了初步概述。

草分枝桿菌；獸醫(yī)；免疫；應用

草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.phlei）是一種在土壤、植物和飲水中廣泛分布的耐酸桿菌，最早由德國人Lehm ann和N eum ann從干牧草中分離純化[1]。由于它對人和動物幾乎無致病性，滅活后其細胞壁等成分具有免疫刺激作用，目前，在臨床上多用作免疫增強劑，是一種寶貴的微生態(tài)制劑資源[2]。

在人醫(yī)領域，草分枝桿菌制劑已經(jīng)得到廣泛應用，其藥理、毒理學研究也較為深入[3]。然而，在畜牧獸醫(yī)領域，草分枝桿菌的研究和應用才剛起步。本文就草分枝桿菌的特性及在獸醫(yī)領域的應用進行了綜述。

1 生物學性質(zhì)

草分枝桿菌屬于放線菌綱放線菌目分枝桿菌科，是一種典型的非致病性腐生菌[1]。菌體多呈短桿狀，無鞭毛、無芽孢，長約1.0～2.0 μm，胞體周圍包裹著分枝菌酸等成分形成的細胞壁，具有抗酸性，革蘭染色不易著色，抗酸染色不規(guī)則。經(jīng)加溫或延長時間著色后能抵抗3%鹽酸酒精的脫色作用[4]。

培養(yǎng)特性上，在凝縮的卵培養(yǎng)基或L-J培養(yǎng)基上生長快速，培養(yǎng)2～5 d后產(chǎn)生粗燥的橙黃色菌落。在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中，菌落扁平光滑，呈現(xiàn)深黃色[1]。不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。

不同菌株基因組長度有所差異，其中常見的RIVM 601174株全長約5 681.954 kb，含有5 435個編碼序列（CDS），4套rRN A操縱子和50個tRN A編碼基因。其GC含量高達69.24%，是分枝桿菌屬中Tm值最高的菌種之一[5]。

2 免疫學性質(zhì)

草分枝桿菌細胞壁富含脂質(zhì)，主要成分是分枝菌酸。菌體干粉中主要為粗蛋白和糖類。滅活處理后，細胞壁活性成分胞壁酰二肽（M DP）、草分枝桿菌多糖（M PS）及CpG免疫調(diào)節(jié)序列等能夠刺激相應免疫細胞產(chǎn)生免疫應答，進而調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強機體免疫力[6]。

2.1 對體液免疫的作用 草分枝桿菌制劑可以增強Th細胞活性，促使Th細胞分泌B細胞生長因子（BCGF）以及B細胞分化因子（BCDF），從而刺激B細胞進入增殖、分化階段，最終促進特異性抗體形成。臨床藥理作用表明，使用本品后血清IgG、IgM滴度增高[7]。

陳仁等在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)分枝桿菌多糖制劑可顯著增強小鼠脾細胞產(chǎn)生抗體的能力，當對每只小鼠每次注射10～0.01μg分枝桿菌多糖（M ps）的各試驗組與對照組比較均有極顯著性差異（P＜0.001）[8]。

2.2 對細胞免疫的作用 草分枝桿菌制劑能顯著增強特異性細胞免疫，促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化、增殖和白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素4（IL-4）、腫瘤壞死因子（TN F）、γ-干擾素（IFN-γ）、促有絲分裂因子（mm F）、巨噬細胞移動抑制因子（M IF）、巨噬細胞凝集因子（M AF）、巨噬細胞趨化因子（M CF）等細胞因子的產(chǎn)生，能夠顯著增強單核-巨噬細胞、自然殺傷（N K）細胞的活性。將草分枝桿菌按0.57 μg/次劑量施加小鼠，共3次，臨床動物藥理實驗證明，TLR4的表達和CD4+，CD25+，Treg可受調(diào)節(jié)[6]。此外，El l ouz等還發(fā)現(xiàn)M DP是細胞壁肽聚糖最小的免疫活性單位，單核-巨噬細胞可通過M APK和N F-κB途徑受其調(diào)控產(chǎn)生IL-1、IL-6和TN F-α等細胞因子，這些細胞因子又可以進一步活化免疫系統(tǒng)[6]。

3 在獸醫(yī)領域的應用

3.1 抗腫瘤作用 草分枝桿菌最初主要用于惡性腫瘤、呼吸道感染等的治療，其細胞壁中熱穩(wěn)定和水溶性的亞組分具有主要的抗瘤活性[6]。其制劑可明顯增強宿主抗腫瘤免疫應答，增加宿主對細胞毒化學治療的耐受力，調(diào)節(jié)機體的免疫功能，提高機體抗腫瘤作用，減少腫瘤復發(fā)。Fi l i on等[9]發(fā)現(xiàn)草分枝桿菌細胞壁可誘導膀胱癌細胞的凋亡。

目前，在產(chǎn)品制劑研發(fā)方面，德國的Sanum-Kahl beck公司研發(fā)的烏體林斯產(chǎn)品仍處于同類領先地位，廣泛用于人醫(yī)和獸醫(yī)的臨床治療上[10]。

3.2 抗寄生蟲作用 Tewari等[11]將滅活的草分枝桿菌全菌制劑以10 m g/只的劑量免疫感染球蟲的肉雞，7 d后，免疫組較對照組盲腸病變減少，生長性能有效提高，血清和膽汁中的IgA水平也顯著提高。同時，還可以治療感染巴貝斯蟲的小牛[12]。

3.3 非特異性抗感染作用 草分枝桿菌制劑能增強正常和免疫系統(tǒng)缺陷的動物對多種病原體如肺炎桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌等感染的非特異性抵抗力，并與抗生素具有協(xié)同作用。劉安石等[13]通過構(gòu)造豬支原體和放線桿菌模型證實草分枝桿菌協(xié)同泰妙菌素、磷酸替米考星治療在控制臨床癥狀的同時，增重效果最好，治愈率明顯高于對照組。草分枝桿菌基于同結(jié)核菌的生物親緣性，通過特殊的物質(zhì)交換，可持久地介入宿主的免疫過程，不斷調(diào)節(jié)機體的免疫能力（尤其是細胞免疫），從而表現(xiàn)出殺菌、清除體內(nèi)病原菌、增強抵抗力等免疫效應，達到治療目的。

3.4 免疫調(diào)節(jié)劑作用 Sreekumar等[14]將滅活草分枝桿菌作為疫苗調(diào)節(jié)劑先給雞群灌服，而后灌服新城疫（F株）活疫苗。結(jié)果顯示，雞群H I抗體較對照組并未出現(xiàn)大的變化，但顯著影響了細胞介導的免疫作用（CM I）。Tew ari等[12]把滅活的巴貝斯蟲做抗原，分別用完全弗氏佐劑（FCA）和滅活草分枝桿菌做為免疫調(diào)節(jié)劑接種小牛，結(jié)果表明，滅活草分枝桿菌具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。中國農(nóng)科院選用草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、鹽酸氣芥、新城疫弱毒苗組成復合免疫增強劑，在幼畜腹瀉的預防中具有顯著而獨特的作用，可以明顯降低發(fā)病率和死亡率[15]。劉安石等[16]在豬群免疫豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗后，飼料中添加0.2%以上的草分枝桿菌，較對照組可有效提高抗體的滴度和持續(xù)時間，增強疫苗的保護效果。

3.5 促生長作用和菌群調(diào)節(jié)作用 涂威等[7]在斷奶仔豬日糧中添加0.1%～0.4%的滅活草分枝桿菌，30 d后測定體重及盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)飼喂組可降低腹瀉率，大腸桿菌數(shù)量大幅減少，乳酸桿菌數(shù)量上升，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

4 應用前景與展望

近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人們對畜產(chǎn)品安全的日益重視，畜禽疾病的防治也不再單依賴抗生素和疫苗。隨之而來的諸如微生態(tài)制劑、多糖類、多肽類等動保產(chǎn)品適應市場需求而發(fā)展迅速[17]。

目前，在實驗室研究上，人醫(yī)對草分枝桿菌的研究相對深入。對其細胞壁的免疫活性成分進行了深入探究。發(fā)現(xiàn)MDP、MPS 和CpG 免疫調(diào)節(jié)序列是其具有免疫調(diào)節(jié)功能的主要成分。在分子和基因水平，Abdallah AM測定了草分枝桿菌（RIVM601174株）全基因組序列。Ellouz 等探討了草分枝桿菌在信號通路中所起的調(diào)節(jié)作用。在獸醫(yī)臨床應用上，SreekumarE 和Tewari AK 做了很多早期探索。先后嘗試驗證了草分枝桿菌對小鼠的抗腫瘤作用、對雞的抗球蟲作用、對牛的巴貝斯蟲的治療作用等，讓人們認識到了草分枝桿菌在畜牧獸醫(yī)領域的應用前景。近年來，國內(nèi)一些研究者也開始關注草分枝桿菌在畜牧獸醫(yī)領域的研究和應用。劉安石等證實了草分枝桿菌對豬衣原體、放線菌、呼吸與繁殖綜合征等疾病的有效治療和調(diào)節(jié)作用。此外，草分枝桿菌具備調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)、促生長和治療非特異性抗感染等作用，是一種寶貴的天然藥物和微生態(tài)制劑資源，符合人們關注畜產(chǎn)品安全，減少抗生素使用的理念。

在產(chǎn)品生產(chǎn)方面，由于草分枝桿菌分許多亞種，不同亞種之間存有功能上的差異，篩選和純化具有臨床醫(yī)用功能的菌株是目前研究的主攻方向。然而，在畜牧獸醫(yī)臨床上，尚未見到曹分枝桿菌的衍生產(chǎn)品，好在國內(nèi)畜牧獸醫(yī)領域?qū)ζ溲芯恳呀?jīng)起步，但是目前無論在實驗室研究或是在臨床應用方面均顯單薄，相信未來在獸藥、飼料添加劑、動保產(chǎn)品等領域草分枝桿菌均有大的發(fā)展空間和光明前景。

[1]布坎南，吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M]，1984：958.

[2]葉維民.草分枝桿菌口服液的研制及其對斷奶仔豬的臨床應用研究[D]，長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2013，11.

[3]黨麗云，張琦，曹思哲，等.草分枝桿菌疫苗輔助治療耐多藥肺結(jié)核臨床及免疫功能觀察[J].陜西醫(yī)學雜志，2004（1）：23-25.

[4]龔真莉，陳國棟，劉光遠.結(jié)核分枝桿菌的分子生物學特點[J]，現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007（3）：19-21.

[5]Abdallah AM, Adroub SA, Arnoux M, et al. AComplete genome sequence of Mycobacteriumphlei type strain. RIVM601174[J]. J Bacteriol,2012, 194(12): 2384-2385.

[6]鐘金鳳，方熱軍.滅活草分枝桿菌免疫調(diào)節(jié)研究進展[J].免疫學雜志，2014，11（30）：1011-1015.

[7]涂威.草分枝桿菌制劑在斷奶仔豬日糧中的應用效果及其機理研究[D]，長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012.6.

[8]陳仁，李郁英，趙文明，等.分枝桿菌多糖（M ps）對小鼠抗SRbc抗體生成細胞增強作用的觀察[J]，首都醫(yī)科大學學報，1992，13（1）：8-9.

[9]Filion MC, Lépicier P, Morales A, et al. Mycobacteriumphlei cell wall complex directly inducesapoptosis in human bladder cancer cells[J]. Brit J Cancer, 1999, 79(2): 229-235.

[10]劉福坤，祁曉平，陳徹.新的免疫增強劑-草分枝桿菌的實驗和臨床研究[J].實用癌癥雜志，2003（2）：126.

[11]Bera AK, Bhattacharya D, Pan D, et al. Effectof heat killed mycobacterium phlei onbody weight gain and management of caecalcoccidiosis in broiler chickens [J]. Res VetSci, 2010, 89(2): 196-169.

[12]Tewari AK, Sharma NN, Rao JR, et al. Effectof Mycobacterium phlei on the development ofimmunity to Babesia bigemina[J]. Vet Parasitol,1996, 62(3/4): 223-230.

[13]劉安石.草分枝桿菌協(xié)同抗生素對豬支原體和放線桿菌的控制研究[J]，中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（2）：213-214.

[14]Sreekumar E, Das SK. Mycobacterium phlei asan oral immunomodulator with newcastle diseasevaccine[J]. Indian J Exp Boil, 2001, 39(10): 989-992.

[15]張顯升，蒲萬霞，但秉成，等.復合免疫增強劑對幼畜腹瀉的預防作用及其機理的研究[J].中國獸醫(yī)科技，1995（07）：35-37.

[16]劉安石，鐘蘭蘭，楊亞，等.草分枝桿菌對豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體水平的影響[J].中國獸醫(yī)雜志2013，49（5），42-44.

[17]萬遂如.動物微生態(tài)制劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應用[J]，現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012（1）：70-72.

Research progress of Mycobacterium phlei and its application in veterinary field

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products, Liaoning Shenyang 110003)

Mycobacterium phlei，which is a valuable resource of microecological preparation, hasgood immunomodulatory effect. It has been widely used in human medicine, however, in veterinarymedicine fields, it is used initially. In this paper, we summarized the biological properties andimmunological properties of Mycobacterium phlei, and discussed its application in veterinary medicine.

Mycobacterium Phlei; Veterinary medicine; Immune; Application

S828.5

A

1672-9692(2016)03-0055-03

2016-01-17

王小柱（1980-），男，本科，中級畜牧師，主要研究方向：動物飼養(yǎng)及疾病防控，畜產(chǎn)品安全監(jiān)督。