芮斌 王永康 文漢

摘要：LC-MS技術(shù)以其分離效能高、速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于前沿科學(xué)領(lǐng)域，而在藥物代謝組學(xué)的應(yīng)用性和研究性教學(xué)中還極少采用。本文以LC-MS聯(lián)用基本原理為基礎(chǔ)，將液相串聯(lián)質(zhì)譜理論與藥物安全性評(píng)價(jià)、毒性反應(yīng)差異、生物標(biāo)志物結(jié)構(gòu)解析等方面的科研應(yīng)用實(shí)踐相結(jié)合，為提高LC-MS技術(shù)在藥物代謝組學(xué)整體的教學(xué)水平提供了參考。

關(guān)鍵詞：LC-MS聯(lián)用技術(shù);藥物代謝組學(xué);教學(xué)初探

中圖分類號(hào)：G642.0 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? 文章編號(hào)：1674-9324（2016）08-0175-02

高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）是藥物代謝組學(xué)應(yīng)用性和研究性教學(xué)常用的分析方法，適于分析穩(wěn)定性較差、難揮發(fā)和小極性的化學(xué)成分。但如何優(yōu)化已建立的分析方法，如何避免離子抑制帶來(lái)的未知干擾和進(jìn)行嚴(yán)格的方法驗(yàn)證，是LC-MS在藥物代謝組學(xué)的教學(xué)研究中亟待解決的問(wèn)題。

一、LC-MS理論實(shí)踐成果

1.LC-MS接口應(yīng)用優(yōu)化。大氣壓離子化技術(shù)（atmospheric pressure ionization，API）是一種在大氣壓下將溶液中的分子或離子轉(zhuǎn)變成氣相離子的技術(shù)。API是目前為止藥物代謝組學(xué)應(yīng)用性和研究性教學(xué)中，對(duì)大多數(shù)藥物及其內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性和定量分析最常用的離子化方式。

2.LC-MS應(yīng)用分析。LC-MS技術(shù)對(duì)樣品預(yù)處理只需簡(jiǎn)單步驟，并在很短的時(shí)間內(nèi)就可以對(duì)選定的靶標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)，但是不能獲得結(jié)構(gòu)信息。采用更高分辨率、靈敏度和專一性的優(yōu)勢(shì)的LC-MSn，可對(duì)極端復(fù)雜基質(zhì)（如血、血漿及其他生物組織）中靶標(biāo)代謝產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)相似的化合物同時(shí)分析和鑒定[1，2]。

二、LC-MS在藥物代謝組學(xué)教學(xué)過(guò)程中存在的問(wèn)題

1.生物樣品采集、預(yù)處理、穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)問(wèn)題。傳統(tǒng)的藥物安全性評(píng)價(jià)方法是基于LC-UV/ELSD的代謝指紋圖譜技術(shù)，無(wú)法達(dá)到其靈敏度的應(yīng)用教學(xué)要求，所表征的化學(xué)信息有限且存在著許多弊端。在新藥安全性研究中，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的LC-MS技術(shù)方法在藥物安全性評(píng)價(jià)和藥物毒性的研究中有著廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。

2.液質(zhì)聯(lián)用條件的優(yōu)化問(wèn)題。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用教學(xué)過(guò)程中要分別考慮針對(duì)液相和質(zhì)譜兩個(gè)方面條件的優(yōu)化，以提高對(duì)代謝物分析研究的準(zhǔn)確度。色譜條件的優(yōu)化主要是流動(dòng)相、流速以及色譜柱等幾個(gè)方面，而質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要針對(duì)離子源、掃描離子等。色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化是相輔相成的。

3.日常儀器的保養(yǎng)維護(hù)問(wèn)題。由于色譜柱平衡及質(zhì)譜儀器的響應(yīng)能力會(huì)隨時(shí)間、儀器老化等因素波動(dòng)，影響分析結(jié)果的可靠性及教學(xué)的可持續(xù)性，因此，需要定期對(duì)分析儀器進(jìn)行保養(yǎng)維護(hù)，將定量定性分析誤差控制在一定范圍內(nèi)。

4.內(nèi)源性代謝物結(jié)構(gòu)的鑒定問(wèn)題。在基于LC-MS/MS技術(shù)的藥物代謝組學(xué)的教學(xué)中，由于生物樣本中被測(cè)組分的結(jié)構(gòu)類型、元素組成等信息均未知，尤其是有限的樣品量及痕量代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定，內(nèi)源性小分子代謝物結(jié)構(gòu)的鑒定仍然是個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題。

三、LC-MS教學(xué)的實(shí)施探索

1.藥物安全性與毒性研究性教學(xué)，優(yōu)化樣品預(yù)處理。在教學(xué)實(shí)踐中，緊扣藥物代謝組學(xué)教學(xué)技術(shù)手段的具體需要，需要建立起研究性和應(yīng)用性教學(xué)規(guī)范化管理制度，并將其變成每個(gè)人遵守的規(guī)則。

在正式分析代謝物信息之前，生物樣的采集過(guò)程尤為重要。血漿和血清采集后需要及時(shí)分離，一般最遲不超過(guò)2小時(shí)，分離后置冰箱中低溫保存。

2.優(yōu)化液質(zhì)條件，提高分析效率及質(zhì)量。在研究性教學(xué)的初期，學(xué)生可以嘗試分別用2ul、5ul和10ul進(jìn)樣，根據(jù)隨進(jìn)樣體積增加得到的具體色譜峰寬變化，自主選擇切實(shí)可行的進(jìn)樣量。實(shí)踐證明，較早檢測(cè)出的峰或靠近溶劑前沿的峰更容易出現(xiàn)拖尾，在液相色譜中用溶于流動(dòng)相且小體積進(jìn)樣最為理想。

在實(shí)際教學(xué)中我們使用50mm小體積色譜柱。對(duì)色譜峰進(jìn)行快速洗脫，要確保在色譜峰上收集到足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)，數(shù)據(jù)系統(tǒng)才能準(zhǔn)確測(cè)定出峰寬、峰面積和保留時(shí)間。在方法驗(yàn)證的過(guò)程中，我們應(yīng)該檢查數(shù)據(jù)采集速率，確保其設(shè)置正確，以優(yōu)化色譜結(jié)果。

3.鑒定生物標(biāo)志物結(jié)構(gòu)與早期診斷，探索新的研究教學(xué)模式。通過(guò)分析給藥前生物體內(nèi)代謝物的水平可以用于預(yù)測(cè)機(jī)體未來(lái)的藥物反應(yīng)表型，這是藥物代謝組學(xué)在教研中鑒定生物標(biāo)志物和指導(dǎo)早期臨床診斷的前提。

4.選擇合適數(shù)據(jù)處理方法，培養(yǎng)自主分析能力。在藥物代謝組學(xué)教學(xué)中，由于生物樣品中內(nèi)源性小分子代謝物成分復(fù)雜、極性差異且含量差異大，高比例的代謝物往往容易覆蓋低含量代謝物的變化，一些含量較低但具有重要生物學(xué)意義的代謝物組分不能被識(shí)別，因此需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)度化處理[6]。

四、實(shí)施總結(jié)

應(yīng)用性和研究性教學(xué)要求在檢測(cè)與測(cè)定藥物代謝組學(xué)分析方法上力求測(cè)量效度、信息涵量和分析效率之間的協(xié)調(diào)與平衡，從而提高了LC-MS在藥物代謝組學(xué)應(yīng)用性教學(xué)的效率和可靠性。

參考文獻(xiàn)：

[1]林艷萍，司端運(yùn)，劉昌孝，等.液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究進(jìn)展分析化學(xué)[J].分析化學(xué)，2007，（35）：1535-1540.

[2]謝躍生，潘桂湘，高秀梅，等.高效液相色譜技術(shù)在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用[J].分析化學(xué)，2007，（34）：1644-1648.

[3]Plumb RS，Stumpf CL，Granger JH，et al. Use of liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and multivariate statimetabolites in biological fluids[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2003，（17）：2632-2638.

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[6]Taylor J，King RD，Altmann T，et al. Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning[J]. Bioinformatics，2002，18（Suppl 2）：241-248.