王會(huì)英，蔣　燁，趙麗麗，唐麗杰，喬薪瑗，姜艷平，崔　文，李一經(jīng)，劉　敏

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱　150030;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱　150030)

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傳染性造血器官壞死病毒微型基因組表達(dá)干擾素對(duì)病毒的抑制效應(yīng)

王會(huì)英1，蔣燁2，趙麗麗1，唐麗杰1，喬薪瑗1，姜艷平1，崔文1，李一經(jīng)1，劉敏2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030)

摘要：為構(gòu)建傳染性造血器官壞死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因組并表達(dá)虹鱒IFN，采用RT-PCR擴(kuò)增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亞克隆入真核表達(dá)載體pCI中，構(gòu)建輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV；將擴(kuò)增獲得的IHNV基因組兩末端序列、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因、虹鱒I型干擾素(IFN)基因克隆到真核表達(dá)載體pCI中構(gòu)建出表達(dá)EGFP的IHNV微型基因組pCI-LFGT和表達(dá)IFN的IHNV微型基因組pCI-LFIT；將pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已接種IHNV HLJ-09毒株的EPC細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定細(xì)胞中IHNV G基因RNA。結(jié)果顯示：構(gòu)建的微型基因組不論與輔助病毒還是與5個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，外源基因均能正確表達(dá)；pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已接種病毒的EPC細(xì)胞組與對(duì)照組相比其中的病毒核酸顯著減少。

關(guān)鍵詞：傳染性造血器官壞死病毒；輔助質(zhì)粒；虹鱒I型干擾素；微型基因組

傳染性造血器官壞死病(Infectious Hematopoietic Necrosis,IHN)是由彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus,IHNV)感染鮭科的魚(yú)類(lèi)引起的一種急性病毒性高度傳染性疾病。IHNV是魚(yú)類(lèi)彈狀病毒的典型代表，致死率高，危害魚(yú)種類(lèi)范圍廣，能感染鮭魚(yú)科的所有品種。目前此病廣泛流行于北美、歐洲、亞洲的各國(guó)，給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)80年代中期IHNV傳入我國(guó)，該病已在局部地區(qū)流行。目前，針對(duì)IHNV尚無(wú)有效的防治方法，需要我們進(jìn)一步研究。

IHNV基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，大小約為11 kb，基因組排列方式為3 Leader-N-P-M-G-NV-L-Trailers 5，分別編碼核衣殼蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、表面糖蛋白(G)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NV)和聚合酶蛋白(L)。病毒基因組RNA不穩(wěn)定和易降解，在對(duì)其體外操作及研究時(shí)比較困難。到上世紀(jì)的90年代初，出現(xiàn)了一種反向遺傳操作技術(shù)[1]，這一問(wèn)題得到了較好的解決。利用該方法能夠?yàn)闃?gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆奠定基礎(chǔ)，更好地研究病毒的基因組及相關(guān)蛋白的功能，而且能夠表達(dá)外源蛋白，實(shí)現(xiàn)抗病毒。2000年，Biacchesi等[2]將表達(dá)T7聚合酶的牛痘病毒和表達(dá)CAT蛋白的IHNV微型基因組共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并孵育IHNV病毒，在細(xì)胞中檢測(cè)到CAT蛋白的表達(dá)。此外，微型基因組一般都缺少自我復(fù)制所必需的蛋白，因此構(gòu)建IHNV反向遺傳體系需要將含有IHNV微基因組、N、P、L等的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞[3-5]。

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建IHNV HLJ-09株反向遺傳系統(tǒng)所需的輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G、pCI-NV以及表達(dá)EGFP的IHNV微型基因組pCI-LFGT和表達(dá)IFN的IHNV微型基因組pCI-LFIT，通過(guò)免疫熒光等方法驗(yàn)證其功能，以期為IHNV HLJ-09株反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建以及其基因組的研究奠定基礎(chǔ)，并且為抗IHNV感染研究提供新的方法和思路。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、病毒、抗體

鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(EPC)由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局劉葒惠贈(zèng)；傳染性造血器官壞死病毒IHNV HLJ-09株由本試驗(yàn)室從黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院渤海試驗(yàn)站暴發(fā)急性疾病的死亡虹鱒組織分離并保存；抗IHNV N蛋白兔血清、抗IHNV dG蛋白兔血清、抗虹鱒IFN蛋白鼠血清均由本試驗(yàn)室制備；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.2質(zhì)粒與菌株

真核轉(zhuǎn)錄載體pCI由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所田志軍研究員贈(zèng)與；感受態(tài)細(xì)胞TG1和pMD18-Tsimple、pGEM-T載體購(gòu)自大連Takara公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本試驗(yàn)室保存。

1.3IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)IHNV HLJ-09株的全基因組序列，用primer5.0設(shè)計(jì)針對(duì)N、G、P、NV、L蛋白的特異性引物(表1)；編碼L蛋白的核酸片段較長(zhǎng)，所以選擇L基因內(nèi)的單一酶切位點(diǎn)Hind III將其分2段進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)合真核表達(dá)載體pCI的特點(diǎn)，在引物的5′末端添加了限制性酶切位點(diǎn)。

表1　擴(kuò)增反向遺傳系統(tǒng)中輔助質(zhì)粒序列的引物

注：斜體加粗為酶切位點(diǎn)，下劃線(xiàn)部分為Kozak序列。

RT-PCR擴(kuò)增IHNV HLJ-09病毒株各片段cDNA序列。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，退火，延伸，20個(gè)循環(huán)(退火及延伸參數(shù)見(jiàn)表2)，72 ℃終延伸10 min。4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。產(chǎn)物經(jīng)純化回收后N、G、P、NV、L2段PCR產(chǎn)物連接到為pMD18-T simple克隆載體，L1段PCR產(chǎn)物連接到為pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，命名為pT-N，pT-G，pT-P，pT-NV，pT-L2，pGEM-T-L1，并對(duì)構(gòu)建的重組菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切，PCR和測(cè)序鑒定；然后將L1，L2片段以相同的酶切位點(diǎn)相連，獲得全長(zhǎng)的L片段；最后將目的片段分別亞克隆到pCI中。重組質(zhì)粒用酶切和PCR方法鑒定，陽(yáng)性克隆送上海生物工程公司測(cè)序。

表2　HLJ-09株基因組各片段PCR反應(yīng)條件

1.4IHNV HLJ-09株微型基因組(pCI-LFGT)的構(gòu)建

以pMD18-T-EGFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增EGFP序列，將HdvRz+Leader序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)；同樣HamRz+Trailer序列引入NheⅠ酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物HdvRz+Leader、EGFP、HamRz+Trailer序列純化回收后克隆于pMD18-T simple Vector，轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒鑒定正確后測(cè)序。

將EGFP通過(guò)融合PCR反向插入到HdvRz+Leader和HamRz+Trailer兩個(gè)片段之間，PCR經(jīng)純化回收連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定正確后測(cè)序驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-LFGT；然后亞克隆至pCI真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒鑒定正確后測(cè)序。

1.5IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)

用LipofectamineTMLTX and PLUSTMReagents (Invitrogen,Carlsbad,CA) 將鑒定正確的pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于EPC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程中設(shè)陰性對(duì)照。間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)蛋白表達(dá)：從培養(yǎng)箱中取出24孔培養(yǎng)板，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定；0.2%的Triton穿孔；3%BSA封閉；分別加入3%BSA稀釋的一抗：pCI-N孔加入的兔抗IHNV-N蛋白血清(1∶500)；pCI-P和pCI-L孔加入兔抗IHNV全病毒血清(1∶500)；pCI-G孔加入兔抗IHNV-dG蛋白血清(1∶500)孵育；加入3%BSA稀釋FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶200)孵育，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.6IHNV HLJ-09株微型基因組和輔助質(zhì)粒功能鑒定

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的EPC細(xì)胞鋪于24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞洗滌后每孔感染100TCID50的IHNV HLJ-09，16 ℃孵育1 h，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)要求將1 μg pCI-LFGT質(zhì)粒加入到轉(zhuǎn)染試劑混合液中，加入細(xì)胞，16 ℃培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀(guān)察EGFP的表達(dá)情況，陰性對(duì)照孔不感染IHNV。

輔助質(zhì)粒鑒定孔轉(zhuǎn)染時(shí)不添加輔助病毒，pCI-LFGT質(zhì)粒與pCI-N、pCI-P、pCI-NV、pCI-L、pCI-G質(zhì)粒的添加比例為10∶5∶5∶2∶1∶1，陰性對(duì)照孔中不含輔助質(zhì)粒pCI-L，16 ℃培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀(guān)察EGFP的表達(dá)情況。

1.7攜帶虹鱒干擾素的IHNV微型基因組的構(gòu)建、鑒定及應(yīng)用

虹鱒攻毒IHNV HLJ-09后第10 d取脾臟研磨后加適量PBS，利用Trizol法提取RNA，以：IFN1 F28a 5′GAATTCTGTGACTGGATCCGA 3′(含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；IFN1 R28a：IFN 5′CTCGAGTCAGTACAT-CTGTG 3′(含有XholⅠ酶切位點(diǎn))為上下游引物RT-PCR擴(kuò)增IFN序列(471 bp)。PCR產(chǎn)物純化回收后測(cè)序鑒定。將IFN基因反向插入到HdvRz+Leader和HamRz+Trailer兩個(gè)片段之間，PCR產(chǎn)物純化回收后克隆入pMD18-T simple中,并進(jìn)行鑒定，鑒定正確后亞克隆入pCI載體中，命名為pCI-LFIT。

將pCI-LFIT與5種輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pCI-LFGT對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照。16 ℃培養(yǎng)72 h，收集并超聲破碎細(xì)胞，用SDS-PAGE 2×上樣緩沖液處理后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩悠愤M(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉，以抗虹鱒IFN蛋白鼠血清(1∶100)為一抗，羊抗鼠HRP-IgG(1∶4000)為二抗，通過(guò)DAB底物顯色進(jìn)行Western blot鑒定。

pCI-LFIT與輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-NV、pCI-L共轉(zhuǎn)染24 h之前已接種100TCID50IHNV HLJ-09毒株的EPC細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照和接種病毒的細(xì)胞對(duì)照，每組設(shè)兩個(gè)平行，48 h后提取各孔R(shí)NA，SYBR Green real-time RT-PCR擴(kuò)增G基因序列，檢測(cè)引物如下：上游引物：5′ GGAGAAATACGTCGCC-CAGTA 3′，下游引物：5′ AACAGCAAGGAGGAGAACCAG 3′ ；擴(kuò)增β-actin內(nèi)參控制序列，檢測(cè)引物如下：上游引物：5′ GATGGACTCTGGTGATGGTGTGAC 3′，下游引物：5′ TTTCTCTTTCGGCTGTG-GTGGTG 3′。運(yùn)用7500 Sy-stem Software實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1IFA檢測(cè)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-G、pCI-P、pCI-L在細(xì)胞中的表達(dá)

熒光顯微鏡下觀(guān)察各轉(zhuǎn)染孔IFA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)染孔均出現(xiàn)特異性的綠色熒光(圖1)，但熒光亮度不同，其中pCI-N轉(zhuǎn)染孔熒光量最多，pCI-L轉(zhuǎn)染孔熒光量最少，pCI-G較pCI-N差些，各質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可能是影響不同蛋白表達(dá)量的重要因素。

圖1　重組質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI在EPC細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物間接免疫熒光結(jié)果(100×)

A：pCI-N轉(zhuǎn)染的EPC細(xì)胞；B：pCI-P轉(zhuǎn)染的EPC細(xì)胞；C：pCI-L轉(zhuǎn)染的EPC細(xì)胞；D：pCI-G轉(zhuǎn)染的EPC細(xì)胞；E：pCI轉(zhuǎn)染的EPC細(xì)胞對(duì)照

2.2IHNV HLJ-09株微型基因組pLFGT的功能鑒定

利用IHNV HLJ-09株作為輔助病毒與微型基因組共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后72 h觀(guān)察發(fā)現(xiàn)IHNV HLJ-09株感染孔在熒光顯微鏡下可見(jiàn)特異性的綠色熒光，而對(duì)照孔呈現(xiàn)陰性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　IHNV微型基因組的功能鑒定(100×)

2.3IHNV HLJ-09株輔助質(zhì)粒的功能鑒定

pLFGT與輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-NV和pCI-G共轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀(guān)察其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)孔出現(xiàn)特異性的綠色熒光，而缺少pCI-L質(zhì)粒的對(duì)照孔無(wú)熒光出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　IHNV輔助質(zhì)粒的功能鑒定(100×)

2.4攜帶虹鱒干擾素的IHNV微型基因組的功能鑒定及應(yīng)用

Western blot檢測(cè)微型基因組表達(dá)的IFN，結(jié)果可知：添加pCI-LFIT孔在27 kDa目的位置處左右出現(xiàn)了特異性條帶，而添加pCI-LFGT孔及細(xì)胞對(duì)照孔無(wú)條帶產(chǎn)生，表明攜帶IFN的IHNV微型基因組得到表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　Western Blot檢測(cè)pCI-LFIT在EPC細(xì)胞中的表達(dá)

1.預(yù)染蛋白 Marker；2.pCI-LFIT轉(zhuǎn)染EPC；3.pCI-LFGT轉(zhuǎn)染EPC；4.EPC細(xì)胞

Real-time PCR擴(kuò)增IHNV-HLJ-09株病毒的G基因和內(nèi)參基因，分別得到IHNV G基因216 bp及β-actin基因167 bp，與預(yù)期目的條帶大小相符。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　IHNV G和IFN基因?qū)崟r(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1,4.DNA Marker 2000bp；2.IHNV G擴(kuò)增結(jié)果；5.鯉β-actin基因擴(kuò)增結(jié)果；3,6.引物PCR對(duì)照；

運(yùn)用7500 System Software實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)定量分析接種IHNV-HLJ-09株的EPC細(xì)胞的病毒感染量。結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染組相比，pCI-LFIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞孔中病毒RNA拷貝數(shù)與空載體及未轉(zhuǎn)染孔相比呈減少趨勢(shì)且差異極顯著(P<0.01)，病毒的復(fù)制效率降低，因此可以認(rèn)為干擾素起到了明顯的抗病毒作用，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　SYBR Green real-time RT-PCR檢測(cè)EPC中

3討論

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)繁殖時(shí)主要遵循負(fù)鏈RNA病毒的復(fù)制原則，而且病毒侵染細(xì)胞和脫衣殼都是在RdRp的指導(dǎo)下完成[6-9]。另外，負(fù)鏈RNA病毒本身不具有感染性，感染周期必須通過(guò)轉(zhuǎn)錄mRNA方能啟動(dòng)[10]。本試驗(yàn)采用的RNA pol II轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)于小基因組的RNA病毒具有高的轉(zhuǎn)錄效率，并且不需要再添加T7 RNA聚合酶，既節(jié)省了篩選穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的復(fù)雜過(guò)程又避免了病毒對(duì)細(xì)胞的病變效應(yīng)，而且此系統(tǒng)對(duì)多種細(xì)胞系有廣泛的應(yīng)用性，如A/J鼠源的293T、BHK-21、NA細(xì)胞等[12]。

本研究采用的微型基因組反向遺傳學(xué)技術(shù)除了要提供輔助蛋白或者病毒，還要涉及基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的示蹤基因，因此采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報(bào)告基因。另外，基因組5′末端和3′末端非翻譯區(qū)序列對(duì)病毒的拯救成敗和效率有重大影響。LeMercier等[13]發(fā)現(xiàn)，之所以依賴(lài)錘頭狀核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)能實(shí)現(xiàn)病毒基因組RNA從5′-3′的精確轉(zhuǎn)錄，是因?yàn)槎嘤嗟牟《净蚪M末端序列會(huì)導(dǎo)致病毒的拯救的效率。切割作用主要利用底物間的互補(bǔ)作用而形成空間結(jié)構(gòu)來(lái)完成,而在3′端的附近存在切割位點(diǎn)[14]；HdvRz包含順式和反式切割兩種結(jié)構(gòu)，反式活性結(jié)構(gòu)的HdvRz通過(guò)基因組的5′端的切割位點(diǎn)，可以切割外源的RNA片段[15]。分析這兩種酶的結(jié)構(gòu)特性，能夠形成一個(gè)可以將病毒基因組包起來(lái)的三明治結(jié)構(gòu)，從而得到一個(gè)完整的IHNV基因組RNA。

本試驗(yàn)通過(guò)SOE-PCR法將IHNV HLJ-09株基因組3′端的Leader序列和N基因5′端的非編碼區(qū)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因、L基因3′端非編碼區(qū)和5′端Trailer序列的片段依次連接[16]，該片段在反向克隆入RNA pol II啟動(dòng)子與丁型肝炎病毒的核酶裂解位點(diǎn)之間構(gòu)建了微型基因組[17]。IHNV直接感染EPC細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)染微型基因組，報(bào)告基因得到表達(dá)，表明此微型基因組RNA可被輔助病毒提供的N、P、L等蛋白翻譯組以及表達(dá)的基因具有IHNV特異性；將所構(gòu)建的5個(gè)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV與微型基因組共轉(zhuǎn)染時(shí)，報(bào)告基因得到表達(dá)，證明這些輔助質(zhì)粒具有輔助其病毒的功能基因。

轉(zhuǎn)染過(guò)程中質(zhì)粒的濃度及純度非常重要，質(zhì)粒均要達(dá)到轉(zhuǎn)染級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，濃度在100 ng/μL以上，純度也要在(OD260nm或OD280nm)1.8~2.0之間。轉(zhuǎn)染前宿主細(xì)胞自身的狀態(tài)良好是病毒拯救的前提，一般選用傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)比較好且密度要在80%長(zhǎng)滿(mǎn)左右[18]，本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)染后每隔幾個(gè)小時(shí)鑒定熒光表達(dá)量，48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)量較高。為了使質(zhì)粒的純度和濃度均達(dá)到轉(zhuǎn)染級(jí)別要求，需要去除內(nèi)毒素及其它雜質(zhì)的影響，搖菌時(shí)間范圍應(yīng)在12~16 h，以保證得到充足的菌體且細(xì)菌又不能釋放出大量?jī)?nèi)毒素而污染。各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的用量要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)的參考和細(xì)胞板的體積選擇相應(yīng)用量。轉(zhuǎn)染效率也與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的質(zhì)量和比例有關(guān)。本試驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化后選擇5個(gè)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV的使用比例為5∶5∶2∶1∶1，報(bào)告基因得到較好表達(dá)。而且對(duì)短復(fù)制體進(jìn)行分析或基因突變的操作要比對(duì)整體基因組的操作要更簡(jiǎn)便。

干擾素系統(tǒng)具有廣譜的抗病毒和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性，靶向表達(dá)于病毒感染細(xì)胞將會(huì)提高治療的效率，并有可能降低副作用。經(jīng)誘導(dǎo)劑(病毒或dsRNA)誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生魚(yú)類(lèi)I型干擾素不但含有抗病毒性，而且非體內(nèi)重組表達(dá)的I型IFN也擁有該活性[19]。本研究在構(gòu)建IHNV微型基因組基礎(chǔ)上，將干擾素作為外源基因反向插入IHNV微型基因組構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCI-LFIT，轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄為具有功能性的RNA，后者在IHNV復(fù)制酶復(fù)合物作用下生成負(fù)鏈RNA，從而啟動(dòng)干擾素的表達(dá)。經(jīng)鑒定，干擾素特異性表達(dá)于EPC細(xì)胞中，并且能夠靶向抑制病毒的復(fù)制。綜上所述，本研究構(gòu)建的含有干擾素的微型基因組能在細(xì)胞水平上一定程度抑制IHNV復(fù)制，但抑制效率還不十分理想，原因可能是與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)水平有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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(責(zé)任編輯：鄧薇)

Infectious haemopoietic necrosis virus minigenome expressing IFN

and its inhibiting effect on virus

WANG Hui-ying1，JIANG Ye2，ZHAO Li-li1，TANG Li-jie1，QIAO Xin-yuan1，

JIANG Yan-ping1，CUI Wen1，LI Yi-jing1，LIU Min2

(1.CollegeofAnimalMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China;

2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract：This study constructed and identified the minigenome of infectious haemopoietic necrosis virus,which expressing rainbow trout IFN-Ⅰ.First,the N,P,L,G and NV protein genes of IHNV HLJ-09 were subcloned into the pCI eukaryotic expression vector by using RT-PCR method,this research constructed pCI-N,pCI-P,pCI-L,PCI-G and pCI-NV support plasmids.Amplifying the both ends of IHNV genome sequences and EGFP reporting genes，rainbow trout type Ⅰ IFN genes,which were cloned into the eukaryotic expression vector pCI to build pCI-LFIT and pCI-LFGT.Transfect pCI-LFGT into EPC cell which was infected by IHNV HLJ-09,the real-time PCR assay was used to detect IHNV G gene RNA replication level and total proteins were extracted for Western blot.The reporter genes in the building minigenome could express correctly both with support virus and co-transfect with five support plasmids.The minigenome containing inverted IFN could specifically be expressed in EPC cell lines infected IHNV,the viral replication level was significantly decreased to a certain extent by real-time PCR detection.

Key words：infectious haemopoietic necrosis virus;support plasmids;rainbow trout IFN-Ⅰ;minigenome

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)01-0003-06

作者簡(jiǎn)介：第一王會(huì)英(1988-)，女，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：huiy_wang@163.com通訊作者：劉敏，E-mail：liumin-707@163.com；李一經(jīng)，E-mail：yijingli@163.com

收稿日期：2015-03-28；

修訂日期：2015-07-22

資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31372568)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2012RCB66)