岳華梅，翟　晴，宋明月，葉　歡，楊曉鴿，李創(chuàng)舉

(農(nóng)業(yè)部淡水多樣性保護重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢　430223)

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基于轉(zhuǎn)錄組測序的興國紅鯉微衛(wèi)星標記篩選

岳華梅，翟晴，宋明月，葉歡，楊曉鴿，李創(chuàng)舉

(農(nóng)業(yè)部淡水多樣性保護重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

摘要：采用Illumina高通量測序技術(shù)，對興國紅鯉(Cyprinuscarpiovar.singuonensis)垂體和性腺等組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選微衛(wèi)星標記并分析其組成及特征。結(jié)果顯示：共獲得13 652個微衛(wèi)星標記，對所得位點進行分類，單核苷酸重復(fù)類型占47.86%，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類型所占比例分別為34.43%、16.32%、1.25%、0.12%以及0.02%。隨機選取30個SSR位點進行PCR驗證，有20對可以擴增出清晰穩(wěn)定的條帶。在24個興國紅鯉個體中對上述位點進行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物為9對。不同位點得到的等位基因范圍為2~4，平均等位基因數(shù)為3.111 1±0.993 8，觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)以及多態(tài)信息含量(PIC)平均值分別為0.597 2±0.233 2、0.539 7±0.178 0和0.467 2±0.172 1。9個微衛(wèi)星位點中，有4個顯著偏離哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)(P<0.05)。Illumina高通量測序提供了一種直觀、高效開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法，所選興國紅鯉群體遺傳多樣性維持較好。

關(guān)鍵詞：興國紅鯉(Cyprinuscarpiovar.singuonensis)；高通量測序；微衛(wèi)星標記

微衛(wèi)星DNA 側(cè)翼序列相對保守，而核心序列具有高突變性，因此可以根據(jù)側(cè)翼序列的保守性設(shè)計引物，通過PCR 方法檢測微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。目前，開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法雖然很多，但大都存在步驟繁瑣、效率低、耗時長等問題。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定成為可能，進一步采用相關(guān)軟件從這些DNA序列中可以開發(fā)出成千上萬的SSR標記。Xu等[1]通過對鯉進行全基因組鳥槍法測序，從中挖掘得到3 470個高質(zhì)量的SNP標記和773個微衛(wèi)星標記，并將其聚類到50個連鎖群中。采用Illumina高通量測序技術(shù)，Li et al.對泥鰍進行了轉(zhuǎn)錄組測序，并通過msatcommander 軟件挖掘出15,106個SSR標記；隨后的PCR擴增驗證表明87.8%的備選位點具有多態(tài)性[2]。因此，高通量測序由于其高效性迅速成為開發(fā)DNA分子標記的首選。

興國紅鯉(Cyprinuscarpiovar.singuonensis) 主要分布在江西省興國縣，它是在自然環(huán)境的影響下逐漸形成的一個鯉魚地方品種，已有超過1300年的養(yǎng)殖歷史[3]。興國紅鯉是重要的雜交親本,在我國魚類雜交育種中具有重要作用。從1972—1984 年,相關(guān)單位已對其進行了6代定向選育,培育出性狀穩(wěn)定的品種[4],目前已選育至20代。在多代選育的過程中，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性是否會由于近期繁殖等影響逐漸降低，目前尚無相關(guān)報道。本研究采用IIlumina高通量測序技術(shù)，從興國紅鯉生殖相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄組序列中，篩選出一批SSR序列并開發(fā)微衛(wèi)星引物，為進一步分析興國紅鯉的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳標記輔助育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集與RNA提取

興國紅鯉取自江西省興國紅鯉良種場。取六尾健康的興國紅鯉垂體、性腺組織(雌雄各3尾)保存于RNA laterTM (Ambion,Austin,TX,USA) 中，4 ℃存放16 h后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。采用Trizol(Invitrogen)法分別提取垂體、精巢、卵巢組織的總RNA，加入DNase(Qiagen) 消化30 min以去除基因組DNA。所提取總RNA 的質(zhì)量和數(shù)量采用安捷倫生物分析儀2100 (Agilent) 和Nanodrop-2000 紫外分光光度儀(Thermo) 進行檢測。

1.2cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序

分別取等量的垂體、精巢、卵巢RNA進行混合(總量100 ng)，利用mRNA-Seq 試劑盒(Illumina)合成cDNA，通過末端修復(fù)、連接接頭和純化，獲得興國紅鯉混合樣品的cDNA 文庫。采用Illumina HiSeq 2000測序儀進行高通量測序，所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為fastq格式用于后續(xù)序列拼接，測序讀長為90 bp。

1.3轉(zhuǎn)錄組拼接

測序所得原始序列(raw reads)通過filter_fq軟件(華大基因)過濾去除接頭引物序列以及低質(zhì)量序列(Q-value=20)。所得干凈序列(clean reads)運用Trinity軟件[5]進行轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。

1.4微衛(wèi)星標記(SSRs)挖掘

采用MISA軟件(MIcroSAtellite;http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa,version 1.0) 挖掘興國紅鯉轉(zhuǎn)錄組序列(>1 000 bp)中的微衛(wèi)星標記[6]。為了鑒定一、二、三、四、五、六核苷酸的重復(fù)，閾值分別被設(shè)為10、6、5、5、5、5。根據(jù)堿基互補配對原則，將所有互補的簡單重復(fù)序列視為一類，因此二核苷酸重復(fù)單元分為AT、AG、AC和CG四種，以此類推，三核苷酸重復(fù)單元可分為10類，四核苷酸重復(fù)單元可分為33類，五核苷酸重復(fù)單元可分為102類，六核苷酸重復(fù)單元可分為350類。

1.5微衛(wèi)星引物設(shè)計與多態(tài)性驗證

挑選兩側(cè)翼區(qū)均足夠長的微衛(wèi)星序列，用Primer5.0軟件設(shè)計引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，退火溫度依引物而異，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠法檢驗后，4 ℃保存。多態(tài)性驗證采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行。選取興國紅鯉個體24個，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后采用銀染法顯色定影，并拍照保存。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

群體擴增結(jié)果統(tǒng)計時，將每個位點所有條帶按照片段從大到小依次命名為A,B,C,D，即為等位基因，并按照每個個體的帶型統(tǒng)計出基因型。利用PopGene32軟件統(tǒng)計每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Allele number,Na)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)[7]、哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)以及位點間連鎖不平衡檢驗(LD)。采用PIC_CALC軟件計算各個位點的多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。采用MicroChecker 2.2.3 (http://www.microchecker.hull.ac.uk/) 計算無效等位基因概率[8]。

2結(jié)果與分析

2.1測序結(jié)果和特性分析

采用Illumina Hiseq 2000對興國紅鯉垂體、精巢、卵巢混合cDNA文庫進行測序，共得到53472104條clean reads，GC含量為49.20%。通過Trinity軟件拼接，總共得到89 511條unigene序列。

2.2SSRs的組成類型分布

為了尋找SSR位點，將拼接所得序列提交到MISA軟件進行分析，總共得到13 652個SSR位點，其中1 760條序列包含一個以上的SSR。根據(jù)重復(fù)單元的類型和重復(fù)次數(shù)，將不同的SSR位點進行分類(表1)，其中數(shù)量最多的SSR基序為單核苷酸重復(fù)，比例占全部重復(fù)序列的47.86%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，比例分別為34.43%和16.32%，四、五、六核苷酸重復(fù)的SSR類型較少，所占比例分別為1.25%、0.12%以及0.02%。

表1　興國紅鯉轉(zhuǎn)錄組中SSRs類型統(tǒng)計

2.3SSR引物篩選結(jié)果及興國紅鯉群體遺傳多樣性分析

選取其中的30個SSR位點設(shè)計引物，進行PCR擴增，其中有20對可以擴增出清晰穩(wěn)定的條帶。對這20對引物在24個興國紅鯉個體中進行PCR擴增，并通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(圖1)，篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物共9對，包括6對復(fù)合SSR位點單元，3對二核苷酸重復(fù)單元，具體引物信息見表2。

圖1　部分微衛(wèi)星引物擴增帶譜

位點引物序列重復(fù)片段退火溫度/℃GenBank注冊號C1F:ATTGAAGTTCTGAGATCAACATGCCATCTTAR:GACCAGATGAGTGCGAGAGATGAAG(CA)655KT384362C6F:GACTTTTTGTTGTTGTAAATACCACCTR:AATCCTCAGTCCTGTTCTCCCAT(GT)655KT384363C7F:CATCTTTGAAGCACAGGTGAGGAGR:TTCACAGCATCTAACATCCTCCATT(CA)655KT384364C8F:CACAAGAGGCAATGTATTACGCAGR:CTTGTTTTGTTGTGGTACAGGACTTC(TG)1255KT384365C10F:CGTAGGAGAGTGTGAGAAGCAGTGAR:ATCGTGGTCTTTATTGGTCAGGC(AG)655KT384366C12F:AAAAACGAGGCAGACAGAAGATGAGR:GCGTGTGTTTTGTTGATTTGATTGT(CT)655KT384367C18F:TGAATGATGCCCAAAAGTCTATGTCR:TGTGAGGACATTTTATGCTCCAGAT(AC)7(TA)854KT384368C21F:TGTTTGAAACTGAATCACTCCGTGTR:TCACAGTCTCACATGCGCGC(GT)8(TG)954KT384369C23F:ACAAAAGTGAGAGGCAGTTTAGAGGR:ACAAGAGAAAATGATTGAGTTTAGGGT(TG)653KT384370

根據(jù)9對SSR 引物在24個個體中擴增片段的分布情況進行統(tǒng)計，得出等位基因數(shù)(Na)在2~4之間，平均等位基因數(shù)為3.111 1±0.993 8，Ho和He分別在0.250 0~1.000 0和0.283 7~0.730 5之間，平均值分別為0.597 2±0.233 2和0.539 7±0.178 0(表3)。多態(tài)信息含量(PIC)在0.239 2~0.663 3范圍內(nèi)，平均值為0.4672±0.1721。其中5個SSR 位點的PIC值均大于0.5，3個位點的PIC值在0.25~0.5之間，2 個位點的PIC值小于0.25(表3)。此外，我們還對每個位點進行了Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗和位點間的連鎖不平衡檢驗(LD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有四個位點(C1、C8、C18、C21)顯著偏離HWE，而位點間的連鎖不平衡檢驗(LD)沒有顯著性(P<0.05)。MicroChecker 2.2.3軟件分析發(fā)現(xiàn)，所選取的9個位點中不存在無效等位基因。

表3　24個興國紅鯉個體中的9個微衛(wèi)星位點的特征描述

3討論

轉(zhuǎn)錄組平臺的構(gòu)建，在很大程度上推動了DNA分子標記的開發(fā)。近年來利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得含有微衛(wèi)星的序列，并對其進行遺傳多樣性的研究在國際上已有很多成功報道[9-10]。采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序，研究者從鰱魚轉(zhuǎn)錄組拼接所得序列中篩選得到13 327個SSR標記[11]。 Ji等[12]采用Roche 454測序法從鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到2 064個微衛(wèi)星標記。同樣的，Liao等[13](2013) 從鯽魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘得到11 295個微衛(wèi)星標記。可見該方法已成功應(yīng)用于大規(guī)模篩選魚類微衛(wèi)星標記位點。本試驗采用Illumina高通量測序平臺對興國紅鯉生殖相關(guān)組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，并從中批量篩選出大量SSR位點。選取具有清晰擴增條帶的20個微衛(wèi)星位點，其中有9個呈現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。相比傳統(tǒng)的SSR篩選方法，該方法篩選效率高，工作量相對較小，適合大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標記位點。這些開發(fā)的位點可能與功能基因相關(guān)，從而可為后續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位等提供有力支持。

群體的遺傳多樣性主要表現(xiàn)在等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量三個方面[14]。本研究所獲得興國紅鯉9個多態(tài)位點的等位基因數(shù)平均為3.111 1±0.993 8，Ho和He平均值分別為0.597 2±0.233 2和0.539 7±0.178 0(表2)。作為衡量多態(tài)信息含量的指標，PIC>0.5為高度多態(tài)性位點， 0.25

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(責任編輯：張紅林)

Development of microsatellite markers in Cyprinus carpio

var.singuonensis using next-generation sequencing

YUE Hua-mei,ZHAI Qing,SONG Ming-yue,YE Huan,YANG Xiao-ge,LI Chuang-ju

(KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgriculture,

YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisheryScience，Wuhan430223，China)

Abstract：The simple sequence repeats (SSRs) were detected from the transcriptome of pituitary and gonad in culturedCyprinuscarpiovar.singuonensisby high-throughput Illumina sequencing,whose classifications and characterization were analyzed as well.It was shown that a total of 13,652 SSRs were found,which were composed of six repeat units types:mononucleotide repeat units (47.86%),dinucleotide repeat units (34.43%),trinucleotide repeat units (16.32%),tetranucleotide repeat units (1.25%),pentanucleotide repeat units (0.12%) and hexanucleotide repeats (0.02%).Twenty out of thirty PCR primers,designed from random SSR sequences,were able to amplify steady and clear sequence bands by PCR.By further PCR amplifications in 24C.carpiovar.singuonensisindividuals,nine of the twenty SSRs were proved to be polymorphic.In addition,the number of alleles,heterozygosity scores,and polymorphism information content (PIC) of the nine SSRs were analyzed.The number of alleles per locus ranged from 2 to 4,with an average of 3.111 1±0.993 8.The average values of observed heterozygosity (Ho),expected heterozygosity (He) and polymorphism information content (PIC) were 0.597 2±0.233 2、0.539 7±0.178 0 and 0.467 2±0.172 1,respectively.The χ2test of Hardy-Weinberg equilibrium revealed that genetic disequilibrium was observed in four SSR loci from the nine loci analyzed.These results indicate that Illumina sequencing provides a direct and high-efficient method to develop microsatellite sites,and the Xingguo red carp population analyzed in this study retained fine genetic diversity.

Key words：Cyprinuscarpiovar.singuonensis;high-throughput sequencing;microsatellite markers

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)01-0024-05

作者簡介：第一岳華梅(1984-)，女，博士，助理研究員，專業(yè)方向為生殖發(fā)育調(diào)控。 E-mail:yhuam@yfi.ac.cn通訊作者：李創(chuàng)舉。 E-mail:lcj@yfi.ac.cn

收稿日期：2015-02-06；

修訂日期：2015-06-23

資助項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目課題一(2011AA100401)