成為為，楊　凱，高銀愛，朱思華，李　波，王青云，羅　峰，夏儒龍，程穎紅，

鄧國(guó)喬，鄭翠華

(武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，武漢　430207)

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基于微衛(wèi)星標(biāo)記建立翹嘴鱖親子鑒定技術(shù)

成為為，楊凱，高銀愛，朱思華，李波，王青云，羅峰，夏儒龍，程穎紅，

鄧國(guó)喬，鄭翠華

(武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，武漢430207)

摘要：利用9個(gè)多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)進(jìn)行親子鑒定分析。結(jié)果顯示，22個(gè)家系翹嘴鱖個(gè)體中共觀測(cè)到95個(gè)等位基因，其觀測(cè)雜合度和期望雜合度的平均值(范圍)分別為0.578(0.219~0.800)和0.607(0.200~0.806)，多態(tài)信息含量(范圍)為0.552(0.187~0.787)。通過軟件Cervus統(tǒng)計(jì)分析得到9個(gè)微衛(wèi)星座位累計(jì)排除率為99.9658%，在27個(gè)可能的父母對(duì)條件下，混養(yǎng)養(yǎng)殖家系后代個(gè)體鑒定準(zhǔn)確率為91%，研究結(jié)果表明篩選的這些多態(tài)微衛(wèi)星分子標(biāo)記可以用于翹嘴鱖優(yōu)勢(shì)家系的鑒定和分離，通過驗(yàn)證的微衛(wèi)星標(biāo)記建立的親子鑒定技術(shù)為基礎(chǔ)選育翹嘴鱖生長(zhǎng)速度快的優(yōu)勢(shì)家系，為培育出生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)的翹嘴鱖新品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)；微衛(wèi)星標(biāo)記；親子鑒定；家系選育

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)為我國(guó)淡水名優(yōu)魚類。自鱖人工繁殖成功以來，翹嘴鱖人工養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，但繁養(yǎng)單位不注重鱖親魚選育和保種工作，在繁殖過程中近親繁殖嚴(yán)重，導(dǎo)致養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源退化、抗病力下降等。培育抗病能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快的優(yōu)勢(shì)品種是鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一。在實(shí)際的養(yǎng)殖實(shí)施過程中，若通過分池飼養(yǎng)可保證準(zhǔn)確的家系信息，卻存在占用空間大、管理強(qiáng)度大等問題，最重要的是不同的養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)性狀的影響會(huì)導(dǎo)致遺傳性狀參數(shù)的估計(jì)誤差。

目前，親子鑒定技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物中已得到廣泛的應(yīng)用，關(guān)于親子鑒定準(zhǔn)確率的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，在水產(chǎn)動(dòng)物如鳀(Engraulisencrasicolus)[1]、鮑魚(Haliotisdiscushanna)[2]、綠蚌貝(Pernacanaliculus)[3]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[4]、日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)[5]等水產(chǎn)動(dòng)物親子關(guān)系鑒定中也有相應(yīng)的應(yīng)用。水產(chǎn)動(dòng)物早期親子鑒定的遺傳標(biāo)記主要有同功酶電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，但存在多態(tài)信息含量相對(duì)較低，以及重復(fù)性、穩(wěn)定性和可比性相對(duì)較差的問題。高度變異的微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)具有檢出率高、信息量大、高度保守、共顯性遺傳、遺傳穩(wěn)定、遵循孟德爾遺傳規(guī)律且檢測(cè)方便快速等特點(diǎn)就成為最有效的分子遺傳標(biāo)記[6]，在種質(zhì)資源調(diào)查、遺傳多樣性評(píng)估和系譜鑒定中顯示了強(qiáng)大的確證作用[7]，可用于確定其父母本、分析家系譜系和確證種屬關(guān)系[8-9]。Dena等[10]的研究更證實(shí)微衛(wèi)星標(biāo)記在沒有外部物理標(biāo)記的人工混合養(yǎng)殖情況下也可以區(qū)分出混養(yǎng)群體所屬的正確家系。本研究以武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所通過家系選育的翹嘴鱖個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料，選取微衛(wèi)星標(biāo)記在翹嘴鱖家系譜系鑒定中進(jìn)行應(yīng)用，利用9對(duì)高度多態(tài)的翹嘴鱖微衛(wèi)星標(biāo)記，通過計(jì)算機(jī)軟件模擬分析，摸索微衛(wèi)星親子鑒定的條件，以及親子鑒定在翹嘴鱖譜系鑒定中的應(yīng)用條件及價(jià)值，為翹嘴鱖新品種的選育提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

2010年5月，課題組分別從廣東省佛山市南海區(qū)石啃魚苗場(chǎng)和武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司引進(jìn)種苗5 000尾，選留500尾具備生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的個(gè)體作為廣東養(yǎng)殖群體建系親本和湖北養(yǎng)殖群體建系親本；2012年3月從湖北省嘉魚縣長(zhǎng)江白沙洲段捕撈50尾1 kg以上的2齡個(gè)體作為野生群體的建系親本。2014年4月，18尾翹嘴鱖繁殖親魚(來自湖北群體、廣東群體和野生群體雌性和雄性各3尾)通過人工繁殖獲得27個(gè)翹嘴鱖全同胞家系，剛開始各個(gè)家系分開養(yǎng)殖，待苗長(zhǎng)到2 cm時(shí)，在每個(gè)家系取2尾確定親緣關(guān)系用于驗(yàn)證微衛(wèi)星標(biāo)記親子鑒定技術(shù)的可靠性。隨后將所有家系后代個(gè)體在各個(gè)家系取1 000尾子代個(gè)體樣本后進(jìn)行混池養(yǎng)殖，并且在相同的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，待子代個(gè)體長(zhǎng)到12月時(shí)，所有子代個(gè)體全部起塘，選取具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的個(gè)體274尾(體重大于500 g)剪鰭條用無(wú)水乙醇保存，并在背部掛上數(shù)字掛牌標(biāo)志用于區(qū)分選育的家系個(gè)體。

1.2PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

DNA提取采用試劑盒法提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后稀釋到約100 ng/μL用于PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)先選取34個(gè)翹嘴鱖微衛(wèi)星標(biāo)記用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性篩選，隨后選取其中9對(duì)多態(tài)性高的微衛(wèi)星標(biāo)記[11-12]合成熒光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如下，PCR反應(yīng)體系為25 μL：TaqDNA聚合酶0.5 μL(1 U/μL)，10×TaqBuffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 100 ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火40 s(各引物最適退火溫度見表1)，72 ℃延伸45 s，38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)自動(dòng)測(cè)序儀ABI 3730 xl(Rox-500 standard)測(cè)序并用軟件GENEMAPPER V.4.0[13]讀取等位基因大小。

1.3家系鑒定分析

利用軟件Cervus 2.0[14]分析各個(gè)基因座上的等位基因頻率、觀測(cè)雜合度Ho和期望雜合度He、多態(tài)信息含量PIC、非親權(quán)排除率(NEP)和累計(jì)非親權(quán)排除率(CEP)，檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位點(diǎn)無(wú)效等位基因頻率，再以父母本雙盲建模(simulation)模擬運(yùn)行10 000次得到Delta分布值，以每個(gè)候選父母的LOD(the nature log of the overall Likelihood atio)值進(jìn)行親子鑒定分析[15]。

2結(jié)果與分析

2.1微衛(wèi)星座位模擬分析

實(shí)驗(yàn)所用9對(duì)微衛(wèi)星引物均能擴(kuò)增出目的條帶，9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析檢測(cè)得到95個(gè)等位基因。其中等位基因數(shù)最少的為座位MDJ879和DQ789303，最多的為座位D290和D295，均檢測(cè)到17個(gè)等位基因(如表1)，其中的6對(duì)標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，微衛(wèi)星測(cè)序圖如圖2所示。其觀測(cè)雜合度為0.219~0.800(平均值為0.578)，期望雜合度為0.200~0.806(平均值為0.607)，多態(tài)性信息含量為0.187~0.787(平均值為0.552)，所有座位均不偏離Hardy-Weinberg指數(shù)。微衛(wèi)星標(biāo)記主要多態(tài)性參數(shù)見表1，非親排除率(NEP)和累積非親權(quán)排除率(CEP)見表2。

表1　本研究所用的9個(gè)微衛(wèi)星引物的主要多態(tài)性參數(shù)和Hardy-Weinberg檢測(cè)結(jié)果

注：NS表示未顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；

圖1　部分引物篩選聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2　翹嘴鱖微衛(wèi)星座位基因分型結(jié)果

2.2分養(yǎng)家系的鑒定

通過Cervus 2.0軟件分養(yǎng)家系44個(gè)子代個(gè)體與18個(gè)親本親子鑒定分析結(jié)果顯示，9個(gè)微衛(wèi)星座位累計(jì)非親權(quán)排除率為99.9658%， 共有40尾在95%非親權(quán)置信區(qū)間LOD值大于零且沒有錯(cuò)配座位(部分?jǐn)?shù)據(jù)如表3)。進(jìn)一步證實(shí)了這9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記用于翹嘴鱖親子鑒定的準(zhǔn)確性。

表2　非親權(quán)排除率(NEP)和累積非親權(quán)排除率(CEP)

表3　翹嘴鱖親子鑒定結(jié)果

注：F：子代個(gè)體；HB：湖北漁場(chǎng)；YT：長(zhǎng)江江段；GD：廣東漁場(chǎng)

2.3混養(yǎng)家系的鑒定

選用已經(jīng)驗(yàn)證可以用于翹嘴鱖親子鑒定的9個(gè)微衛(wèi)星座位對(duì)選育出來的278尾優(yōu)勢(shì)翹嘴鱖進(jìn)行親子鑒定分析，結(jié)果顯示，其中86尾來自廣東2號(hào)(雌)與廣東5號(hào)(雄)繁殖后代，51尾來自廣東3號(hào)(雌)與廣東5號(hào)(雄)繁殖后代；而湖北親本總共產(chǎn)生49尾優(yōu)勢(shì)后代個(gè)體，3尾雌魚親本和3尾雄魚親本優(yōu)勢(shì)后代沒有顯著性差異；長(zhǎng)江2號(hào)(雌)和3號(hào)(雌)分別與3尾雄魚產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)后代為18尾和15尾。

3討論

3.1翹嘴鱖的家系鑒定

傳統(tǒng)物理標(biāo)記主要有外部形態(tài)的區(qū)分[16]、茜素絡(luò)合物或鹽酸四環(huán)素溶液浸泡魚仔、耳石標(biāo)記、可見熒光標(biāo)記(VIE)或編碼金屬標(biāo)(CWT)[17]，這些方法存在操作繁瑣、費(fèi)用昂貴、對(duì)魚體有傷害且標(biāo)志容易脫落等缺點(diǎn)。而微衛(wèi)星分子標(biāo)記因其數(shù)量較多、分布廣泛、多態(tài)性豐富等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年廣泛應(yīng)用于基因連鎖圖譜構(gòu)建[18]、親緣關(guān)系鑒定[19-20]、遺傳多樣性分析[21]等諸多領(lǐng)域。翹嘴鱖選育過程中為保持正確的系譜關(guān)系需借助分子標(biāo)記進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定。用微衛(wèi)星DNA測(cè)序法進(jìn)行親子鑒定技術(shù)精確度高，且發(fā)展快，但早期由于成本較高在水產(chǎn)動(dòng)物中較難開展和推廣，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，親子鑒定技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物中得到廣泛的應(yīng)用?；谝陨虾Y選合適的分子標(biāo)記用于親子鑒定，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的血型、DNA指紋等方法。

本研究中，通過9個(gè)有效的微衛(wèi)星標(biāo)記從18個(gè)候選親本中鑒定子代父母本，鑒定的準(zhǔn)確率則很大程度上受所選微衛(wèi)星分子標(biāo)記的影響，即對(duì)數(shù)目相同的標(biāo)記而言多態(tài)性越豐富其鑒定準(zhǔn)確率越高，本研究中當(dāng)座位數(shù)達(dá)到4個(gè)時(shí)，CEP(累積排除概率)就超過了97.50%；座位數(shù)達(dá)到6個(gè)時(shí)，CEP值為99.92%；座位數(shù)為9個(gè)時(shí)，CEP為99.97%(表2)，進(jìn)一步確定了這9個(gè)座位用于翹嘴鱖親子鑒定的準(zhǔn)確性，將親子鑒定技術(shù)運(yùn)用在翹嘴鱖育種過程中，能夠更加準(zhǔn)確地構(gòu)建家系，有效地避免近親交配，防止種質(zhì)退化。

3.2優(yōu)勢(shì)家系個(gè)體的確定

品種是生產(chǎn)養(yǎng)殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，培育生長(zhǎng)速度快、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗病力強(qiáng)的優(yōu)良品系是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖增產(chǎn)和農(nóng)民增收的有效途徑。傳統(tǒng)的新品種培育方法主要是選擇育種，已經(jīng)培育的水產(chǎn)動(dòng)物新品種，如荷包紅鯉(Cyprinuscarpiovar.Wuyuanensis)、德國(guó)鏡鯉(C.carpioL.)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengzesis)選育系等。傳統(tǒng)育種方法對(duì)推動(dòng)世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重要的作用，但育種周期長(zhǎng)、預(yù)見性差、工作量大、工作效率低等問題嚴(yán)重制約了選擇育種的快速發(fā)展。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Microsatellite DNA markers for parentage test of

Siniperca chuatsi

CHENG Wei-wei,YANG Kai,GAO Yin-ai,ZHU Si-hua,LI Bo,WANG Qing-yun,LUO Feng,

XIA Ru-long,CHENG Ying-hong,DENG Guo-qiao,ZHENG Cui-hua

(WuhanFisheriesScienceResearchInstitute,WuhanAcademyofAgriculturalScience&Technology,Wuhan430207)

Abstract：In this study,9 microsatellite markers were used to analyses the paternity test ofS.chuatsi.A total of 95 alleles were obtained and the mean observed and expected heterozygosis was 0.578 and 0.607,respectively.The combined non-exclusion probability (first parent) of 9 loci was 99.9658%.For the 27 putative parents,the testing accuracy was 91%.The results indicated that the microsatellite DNA markers can be used for the parentage determination ofS.chuatsi.

Key words：Sinipercachuatsi;microsatellite loci;parentage test;superior families

中圖分類號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)01-0029-04

作者簡(jiǎn)介：第一成為為(1986-)，女，博士，主要研究方向?yàn)檫z傳育種。E-mail：chengweiwei9922@163.com通訊作者：高銀愛。E-mail：304104752@qq.com

收稿日期：2015-04-20；

修訂日期：2015-10-10

資助項(xiàng)目：武漢市農(nóng)科院創(chuàng)新項(xiàng)目