●米 佳高勝男 朱浩宇 陳 曦 樸春麗

苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達的影響※

●米 佳*高勝男 朱浩宇 陳 曦 樸春麗▲

目的：觀察苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪中脂肪酸生成酶(FAS)蛋白表達的影響。方法：將高脂飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級ZDF(Zucker Diabetic Fatty )大鼠隨機分為模型組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組，普通飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級ZL(Zucker Lean)大鼠為正常對照組，每組各10只?？嗨嵬ㄕ{(diào)組按照3.29g·kg-1灌胃給藥，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥，模型組、正常對照組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)12周。經(jīng)Western blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組FAS蛋白表達明顯升高(P<0.05)；苦酸通調(diào)方組及吡格列酮組可明顯降低FAS蛋白表達，與模型組比較有明顯改善(P<0.01)。結(jié)論：苦酸通調(diào)方可明顯降低糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達。

苦酸通調(diào)方 2型糖尿病 胰島素抵抗 脂肪酸合成酶

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征[1]。隨著生活方式的改變，生活水平的提高，糖尿病以其較高的發(fā)病率成為嚴重影響人類健康的問題。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病的兩個基本環(huán)節(jié)[2]。脂肪酸合成酶(FAS)是膽固醇及脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，在脂肪酸和甘油三酯代謝中發(fā)揮著重要作用[3]，是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成內(nèi)源性長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶[4]。其表達的改變可能是肥胖、2型糖尿病發(fā)生的分子基礎(chǔ)之一。本實驗研究苦酸通調(diào)方對ZDF大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達情況的影響，進一步研究本方的可能機制。

1 材料

1.1 藥物 苦酸通調(diào)方(由黃連、烏梅、大黃、干姜4味中藥組成，由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院顆粒藥房提供)；吡格列酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：國藥準字H20040631)。

1.2 動物 SPF級9周齡雄性ZDF大鼠，體重(244～291)g；SPF級9周齡雄性ZL大鼠，體重(183～220)g，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證：SCXK(京)2014-0003。大鼠在北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗室中飼養(yǎng)，實驗室溫度20～22℃，相對濕度(55±5)%，12/12小時光照黑暗循環(huán)。適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.3 試劑 FAS(批號：PW2-3)、抗體(批號：3777R-100)、Anti-FAS(批號： CA1101)、Anti-GAPDH(批號：25007)均購自美國CST公司；蛋白裂解液+苯甲基磺酰氟(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0006)均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.4 儀器 調(diào)節(jié)臺式高速低溫離心機(HERAEUS Fresco 17，Thenno Scientific，USA)；溫控震蕩儀(Thenno Scientific，USA)；電泳儀、電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(PowerPac Basic，Bio-Rad，USA)；酶標儀(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad ，USA)；凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon GIS-1000，上海)。

2 方法

2.1 自發(fā)性肥胖2型糖尿病大鼠模型制備 ZDF大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予高脂飼料#5008[購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0008，粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%]喂養(yǎng)。大鼠定期行糖耐量實驗，試驗前禁食不禁水15h，剪尾取血，微量血糖儀測空腹血糖后，予30%葡萄糖溶液按2g·kg-1灌胃[5]。糖負荷后分別在0.5h、1h、1.5h和2h剪尾取血，用血糖儀測量血糖。當血糖峰值高于16.7mmol·L-1和/或糖負荷后2h高于11.1mmol·L-1時，可診斷為糖尿病或糖耐量減低，表明造模成功。

2.2 分組及給藥 將造模成功的ZDF大鼠30只隨機分為模型組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組各10只；10只ZL大鼠為正常對照組?？嗨嵬ㄕ{(diào)方組按照3.29g·kg-1(前期工作已確定的最佳劑量)混懸液灌胃給藥[6]；吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥；正常對照組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃12周，每日1次。給藥期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其他組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量。2.3 標本采集、制備 給藥12周后，將大鼠處死后打開腹腔，迅速取出腹部脂肪組織，把組織剪切成細小的碎片，PMSF與PIPA裂解緩沖液以1：100的比例加入組織中，渦旋振蕩，冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，將勻漿液其置于EP管中，4℃、13000rpm·min-1離心30min，收集中層清液，用于檢測FAS蛋白的表達。

2.4 Western blot法檢測腹部脂肪組織FAS蛋白的表達 裂解脂肪細胞并勻漿，離心取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取樣品5μL，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，Anti-FAS、Anti-GAPDH抗體稀釋液與膜充分接觸，4℃過夜，TBST中室溫脫色，放入二抗稀釋液，封閉，37℃孵育1h，顯影曝光、洗片，掃描儀掃描電泳調(diào)帶，軟件進行光密度值分析。

3 結(jié)果

在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、苦酸通調(diào)組大鼠腹腔脂肪組織中FAS蛋白的表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)；苦酸通調(diào)組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)，說明苦酸通調(diào)方和吡格列酮均能降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織FAS蛋白的表達水平，且苦酸通調(diào)組降低幅度大于吡格列酮組(P<0.05)。見表1、圖1。

分組FAS正常對照組0.54±0.03模型組0.96±0.02*吡格列酮組0.74±0.01*△苦酸通調(diào)組0.67±0.02*△#

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與吡格列酮組比較，#P<0.05。

圖1 各組大鼠脂肪組織中FAS蛋白的表達(Western blot條帶圖)

4 討論

由于人們生活方式改變和體力活動缺乏的現(xiàn)狀，在中國DM的患病率逐年增加，是繼腫瘤、心血管疾病之后世界第三大威脅人類健康的疾病。本課題組所在團隊經(jīng)十余年的臨床和動物實驗研究[7，8]證實，六郁和絡(luò)滯并存是導致肥胖2型糖尿病的核心病機。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態(tài)；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡(luò)脈。絡(luò)滯是由六郁交互作用而形成絡(luò)脈郁滯的病理狀態(tài)?？嗨嵬ㄕ{(diào)方是以四氣五味藥性理論設(shè)立苦酸通調(diào)法，以苦味藥為主，與酸味藥相配合，由《溫病條辨》所記載的連梅湯(黃連、烏梅)加大黃、干姜而成。苦酸通調(diào)方按照君臣佐使的組方原則進行藥物配伍，以“六郁和絡(luò)滯”的病機理論為基礎(chǔ)，治療以清熱瀉火，養(yǎng)陰生津，解毒通絡(luò)為原則，以苦酸通調(diào)為治療大法。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)[9]，苦酸通調(diào)方對肥胖2型糖尿病胰島素抵抗患者有較好的改善作用。

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，糖尿病模型組大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達量顯著上調(diào)，苦酸通調(diào)方組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達，這可能是苦酸通調(diào)方抑制脂肪信號通路的傳導而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。這為我們以后開展中藥復(fù)方有效物質(zhì)的研究提供了思路。

[1]陳艷芬，王春怡，李衛(wèi)民，等.黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應(yīng)激和NF-KB表達的影響[J].中成藥，2012，34 (8)：1428-1432．

[2]Lanuza-Masdeu J，Arévalo mI，Vila C，et al.In vivo JNK activation in pancreatic β-cells leads to glucose intolerance caused by insulin resistance in pancreas[J].Diabetes，2013，62(7)：2308-2317.

[3]Menendez J A.Vazquez Martin A，Ortega F J，F(xiàn)emandez Real JM.Fatty acid synthase.Association with insulin resistance，type 2 diabetes and cancer[J].Clin Chem，2009，55(3)：425-38.

[4]ChoiW J，Jeon B N，Park H，et al.Proto oncogene FBI-1(Pokemon) and SREBP-1 synergistically activate transcription of fattyacid synthase gene(FASN)[J].Chin Phamacol Bull，2006，22(7)：780-784.

[5]Pick A，Clark J，Kubstrup C，et al．Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat [J]．Diabetes，1998，47(3)：358-64.

[6]樸春麗，陳 曦，于 敏，等.消渴脂平干預(yù)自發(fā)Ⅱ型糖尿病大鼠炎癥及脂代謝的實驗研究[J].吉林中醫(yī)藥，2011，31(4)：379.

[7]王淑俊，樸春麗，劉禹辛.苦酸通調(diào)I號方治療肥胖型2型糖尿病40例臨床觀察[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2009，22(4)：221-222.

[8]樸春麗，鄧 悅，米 佳.苦酸通調(diào)法抑制糖尿病脂肪組織炎癥機制的理論探討[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2009，22(3)：146-148.

[9]樸春麗，陳 曦，米 佳.苦酸通調(diào)法治療糖尿病前期的臨床研究[J].中外健康文摘，2012，9(44)：128.

吉林省自然科學基金項目(No.201115169)

米佳，女，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌及代謝病的研究。

▲通訊作者 樸春麗，女，醫(yī)學博士后，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導師。研究方向：中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌及代謝病的研究。E-mail：pcl2013@sina.cn

長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(130021)