賈志宇,郭　濤,莊志征,岳　磊,楊　威,張英懷*(.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔頜面外科，河北 石家莊 050000;.河北省胸科醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 05004; .河北大學附屬醫(yī)院口腔科，河北 保定 07000)

?

·論著·

院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事頭頸腫瘤疾病診治研究。

Bcl-2家族蛋白在萊菔硫烷誘導人涎腺腺樣囊性癌細胞系ACC-M凋亡中的作用

賈志宇1,郭濤2,莊志征3,岳磊1,楊威1,張英懷1*(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔頜面外科，河北 石家莊 050000;2.河北省胸科醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050041; 3.河北大學附屬醫(yī)院口腔科，河北 保定 071000)

[摘要]目的觀察萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)對腺樣囊性癌細胞ACC-M中Bcl-2家族成員表達的影響，探討B(tài)cl-2家族蛋白在SFN誘導ACC-M細胞凋亡中的作用。方法20或40 μmol/L SFN處理ACC-M細胞特定時間后，采用倒置顯微鏡，Wright-Giemsa染色和透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。40 μmol/L SFN處理細胞4、8、16、24 h，采用Western blot方法檢測Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL的表達。結(jié)果倒置顯微鏡，Wright-Giemsa染色和透射電鏡顯示SFN可誘導ACC-M細胞凋亡，流式細胞術(shù)檢測可見凋亡率隨處理時間延長和藥物濃度增加而上升，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)40 μmol/L SFN處理后，促凋亡蛋白Bax、Bak的表達以及Bax/Bcl-2比值隨著時間的延長而增加，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達隨時間延長逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論SFN以濃度-時間依賴方式誘導ACC-M細胞凋亡，并上調(diào)Bax和Bak的表達，下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表達。SFN對Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)可能是其誘導凋亡的機制。

[關鍵詞]口腔腫瘤；萊菔硫烷；細胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.010

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是異硫氰酸鹽的衍生物，天然存在于十字花科蔬菜中，在某些花椰菜品種中含量非常高，因其出色的抗腫瘤效果受到了極大關注[1]。SFN對前列腺癌[1]、乳腺癌[2]、白血病[3]、結(jié)腸癌[4]、口腔癌[5]等多種人類腫瘤都有化學預防和治療作用。但是，少有SFN對人涎腺腺樣囊性癌細胞系作用的研究報道。Bcl-2家族成員在細胞凋亡的基因調(diào)控過程中起著重要的作用。目前已知的Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfel、Al、Ced-9等)和促凋亡蛋白(如Bcl-rambo、Bid、Bax、Bak、Bcl-xS、Bad、Bik、PUMA等)[6]，它們之間通過組成同源二聚體、異源二聚體來促進或抑制細胞凋亡。本研究采用SFN處理體外培養(yǎng)的人腺樣囊性癌細胞系ACC-M，用蛋白質(zhì)印跡法檢測SFN處理不同時間后抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL以及促凋亡蛋白Bax、Bak的表達，驗證Bcl-2家族成員在SFN誘導ACC-M凋亡過程中作用,報告如下。

1材料與方法

1.1材料人腺樣囊性癌細胞系ACC-M由上海交通大學口腔頜面外科實驗室提供。D′ L-SFN(純度≥99%)購自美國LKT實驗室。Annexin-V-FITC/PI試劑盒購自北京聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。Pvdf膜購自美國Millipore公司。兔抗人Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體及二抗購自美國KPL公司。

1.2細胞培養(yǎng)和藥液配制ACC-M細胞采用RPMI1640培養(yǎng)液加入10%胎牛血清和抗生素，于37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)飽和濕度培養(yǎng)，以0.04%二乙胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和0.25%胰蛋白酶混合液消化傳代。SFN用二甲基亞砜配置成100 mmol/L的儲存液，儲存于-20 ℃冰箱中，使用前用培養(yǎng)液稀釋。實驗組SFN終濃度為20 μmol/L或40 μmol/L，培養(yǎng)液中加入等量二甲基亞砜作為對照組(終濃度0.04%)。

1.3方法

1.3.1細胞形態(tài)學觀察3×105個細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，倒置顯微鏡觀察細胞在對照組和實驗組中不同培養(yǎng)時間的生長狀況。2×105個細胞接種于6孔板中，孔中放置蓋玻片，爬片成功后加入20、40 μmol/L SFN或0.04%二甲基亞砜液，培養(yǎng)0、24、48和72 h后，Wright-Giemsa染色，光鏡觀察。細胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，貼壁成功后加入40 μmol/L SFN或0.04%二甲基亞砜，處理48 h后，制備電鏡標本，透射電鏡下觀察2組細胞的超微結(jié)構(gòu)差異。

1.3.2細胞凋亡率檢測 3×105個細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中。分為24、48、72 h組，處理濃度為40 μmol/L，觀察固定濃度SFN處理不同時間的細胞凋亡率；分別用0.04%二甲基亞砜，20、40 μmol/L的SFN處理細胞48 h，觀察固定時間不同濃度SFN處理細胞的凋亡變化。處理完畢并獲取細胞后，用Annexin-V-FITC和PI雙標記活細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法8×105個細胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，實驗組和對照組各4瓶。貼壁后，實驗組加入40 μmol/L SFN，對照組加入0.04%二甲亞砜 。分別培養(yǎng)4、8、16和24 h后，獲取細胞。裂解細胞，提取蛋白質(zhì)并測定濃度。經(jīng)過上膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、加一抗、二抗、免疫顯色，產(chǎn)生條帶。實驗重復3次。采用電泳凝膠成像分析軟件ImageJ2x測量條帶的灰度值，每個指標由同一人測量灰度值2次，得到6組數(shù)值，對結(jié)果進行量化分析。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料比較分別采用F檢驗、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1倒置顯微鏡觀察對照組細胞貼壁生長，細胞生長迅速，多呈扁平多角形，呈“鋪路石”狀生長，胞質(zhì)飽滿，細胞中央處可見圓形細胞核(圖1A)；實驗組細胞生長受到明顯抑制，并可見有脫壁細胞、部分貼壁細胞變圓、皺縮變小、核顏色加深、細胞間連接松解、細胞折光性增強等凋亡表現(xiàn)(圖1B)。

2.2Wright-Giemsa染色對照組細胞核漿比例大，并且可見多個核仁(圖1C)；而實驗組核漿比例降低，胞質(zhì)濃縮，核仁顯著減少甚至消失，并可見部分細胞染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列，發(fā)現(xiàn)細胞核碎裂等凋亡現(xiàn)象(圖1D)。

2.3透射電鏡觀察對照組細胞核漿比例大，核仁明顯，細胞內(nèi)各細胞器清晰可見，功能亢進，可見明顯分裂象(圖1E)；實驗組胞質(zhì)濃縮，核漿比例小，核仁減少甚至消失，出現(xiàn)明顯的染色體邊集現(xiàn)象，并可見凋亡小體(圖1F)。

圖1ACC-M細胞形態(tài)學改變

A.對照組(倒置顯微鏡 ×200)；B.SFN 20 μmol/L處理24 h(倒置顯微鏡 ×200)；C.對照組 (Wright-Giemsa ×200)；D.SFN 40 μmol/L處理24 h(Wright-Giemsa ×200)；E.對照組 (透射電鏡 ×4 000)；F.SFN 40 μmol/L處理48 h(透射電鏡 ×4 000)

Figuer 1Morphology changes of ACC-M cells

2.4不同培養(yǎng)時間和不同SFN濃度處理后凋亡率比較隨著培養(yǎng)時間延長，凋亡率逐漸升高，48 h和72h與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),

72 h與48 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著SFN濃度增加，凋亡率逐漸升高，40 μmol/L組與20 μmol/L組和對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.5SFN處理不同時間ACC-M細胞Bcl-2家族蛋白表達SFN處理后不同時間的ACC-M細胞Bak、Bax蛋白表達和Bax/Bcl-2比值呈逐漸升高的趨勢，而Bcl-2和Bcl-xL呈逐漸降低趨勢，見圖2，表2。

表1SFN處理ACC-M細胞不同時間和不同濃度凋亡率比較

Figure 1Apoptosis rate of ACC-M cells after treatment with different concentration of SFN for different time

(n=3,±s，%)

(n=3,±s，%)

組別凋亡組別 凋亡對照組 7.86±1.20對照組 6.10±0.9524h組12.31±2.1520μmol/L組13.10±5.0148h組26.43±3.68*#40μmol/L組26.43±3.68*#72h組55.33±8.95*#△F 55.195F 24.276P 0.000P 0.001

*P<0.01與對照組比較#P<0.01與24 h或20 μmol/L組比較△P<0.01與48 h組比較(q檢驗)

圖2SFN 40 μmol/L處理4、8、16、24 h后ACC-M細胞中Bcl-2家族蛋白表達(Western blot)

Figure 2Western blot analysis for protein expresson of Bcl-2 family in ACC-M treated with 40 μmol/L SFN for 4,8,16 and 24 h

表2SFN處理后ACC-M細胞中Bcl-2家族蛋白表達及Bax/Bcl-2比值變化

Table 2　Fold changes and ratio of Bax/Bcl-2 for Bcl-2 family in ACC-M treated with SFN(n=6,±s)

Table 2　Fold changes and ratio of Bax/Bcl-2 for Bcl-2 family in ACC-M treated with SFN(n=6,±s)

組別BakBaxBcl-2Bcl-xLBax/Bcl-2對照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.000.35±0.054h組1.10±0.05*1.15±0.07*0.89±0.02*0.89±0.05*0.45±0.068h組1.20±0.07*#1.26±0.09*0.72±0.04*#0.65±0.08*#0.60±0.0716h組1.29±0.09*#△1.42±0.14*#△0.56±0.06*#△0.51±0.06*#△0.89±0.13*#△24h組1.44±0.08*#△☆1.65±0.19*#△☆0.43±0.07**#△☆0.41±0.08*#△☆1.36±0.30*#△☆ F39.0627.45157.597.3521.06 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與4 h組比較△P<0.05與8 h組比較☆P<0.05與16 h組比較(SNK-q檢驗)

3討論

腺樣囊性癌是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤浸潤性極強，沿面神經(jīng)生長并且易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其遠處轉(zhuǎn)移率在口腔頜面部居首位。該病的治療手段主要是手術(shù)切除，但是術(shù)后10年的的神經(jīng)侵襲率和遠處轉(zhuǎn)移率仍高達50%和39%[7]。因此，有必要探索新的治療方法，以提高治療腺樣囊性癌的效果，減少局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，改善患者的生存質(zhì)量。目前，具有抗腫瘤活性的植物有效成分的研究受到重視，其中包括SFN。本研究采用倒置顯微鏡，Wright-Giemsa染色和透射電鏡觀察到，經(jīng)SFN處理的ACC-M細胞出現(xiàn)典型凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)，證明SFN能夠誘導ACC-M細胞凋亡。流式細胞術(shù)也顯示，ACC-M細胞凋亡率與SFN處理時間和濃度有一定相關性。但是SFN誘導ACC-M細胞凋亡的機制尚不清楚。

本研究前期實驗表明，在SFN誘導ACC-M細胞凋亡的過程中，Caspase-3和9的活性顯著增高，說明內(nèi)源性凋亡途徑，即線粒體途徑參與了SFN誘導的凋亡[8]。Bcl-2家族蛋白是公認的調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的重要凋亡因子。其中Bax在藥物誘導刺激后，基因活化，導致其蛋白含量增加，并形成Bax同源二聚體或異源二聚體，引起細胞色素C的釋放，繼而激活Caspase級聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡[9]。而Bcl-2可以對抗引起線粒體破裂的離子失衡，阻斷線粒體凋亡誘導因子如細胞色素C向細胞質(zhì)內(nèi)釋放，從而抑制細胞凋亡[10]。Bcl-xL蛋白與Bcl-2蛋白有74%的同源性。Bcl-xL蛋白與Bcl-2蛋白協(xié)同可使細胞的生存期延長，也可通過激活可溶性單體Bax，抑制Bax蛋白結(jié)合到線粒體外膜，阻止其與膜上的其他蛋白發(fā)生齊聚反應，從而對細胞凋亡起到相應的抑制作用[10]。Bak蛋白的促凋亡作用可能是通過誘導線粒體外膜穿孔導致線粒體破裂來實現(xiàn)的。Bak蛋白可以與Bcl-2和Bcl-xL蛋白結(jié)合，形成異源二聚體，抑制Bcl-2和Bcl-xL的抑凋亡活性，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生，其誘導凋亡的效果大于Bax[11]。本研究結(jié)果顯示，SFN處理可上調(diào)ACC-M中促凋亡蛋白Bax和Bak的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達。證明Bcl-2家族蛋白在SFN誘導ACC-M凋亡過程中起重要作用。Bax/Bcl-2在同一組織細胞中的表達比值可以決定細胞的存亡,即Bax/Bcl-2比值高的細胞促凋亡,細胞趨向死亡,而Bax/Bcl-2比值低的細胞抑凋亡,細胞趨向生存[10]。本研究結(jié)果顯示，用藥后Bax/Bcl-2比值與對照組相比明顯增大。這可使腫瘤細胞對凋亡更敏感，更易發(fā)生凋亡，可能是SFN誘導細胞凋亡、發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制之一。

Bcl-2家族的轉(zhuǎn)錄受到其上游的STAT蛋白的調(diào)控，研究顯示SFN可以下調(diào)頭頸癌細胞PCI-13中STAT3的磷酸化水平，減少STAT3的構(gòu)成性激活和IL-6誘導的激活[12]。在ACC-M細胞中Bcl-2家族的變化是否受STAT3調(diào)控，值得進一步研究。另外，本研究的前期實驗也顯示SFN可提高Caspase-8的活性[8]，說明死亡受體途徑也參與SFN誘導的凋亡，SFN能否影響Fas、腫瘤壞死因子α等凋亡蛋白的表達，也是我們下一步的工作。

[參考文獻]

[1]Labsch S,Liu L,Bauer N,et al.Sulforaphane and TRAIL induce a synergistic elimination of advanced prostate cancer stem-like cells[J].Int J Oncol,2014,44(5):1470-1480.

[2]Hussain A,Mohsin J,Prabhu SA,et al.Sulforaphane inhibits growth of human breast cancer cells and augments the therapeutic index of the chemotherapeutic drug,gemcitabine[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(10):5855-5860.

[3]Suppipat K,Park CS,Shen Y，et al.Sulforaphane induces cell cycle arrest and apoptosis in acute lymphoblastic leukemia cells[J].PLoS One,2012,7(12):e51251.

[4]Constantinescu S,Hecht K,Sobotzki N,et al.Transcriptomic responses of cancerous and noncancerous human colon cells to sulforaphane and selenium[J].Chem Res Toxicol，2014,27(3):377-386.

[5]Jee HG,Lee KE,Kim JB,et al.Sulforaphane inhibits oral carcinoma cell migration and invasion in vitro[J].Phytother Res,2011,25(11):1623-1628.

[6]Bai L,Chen J,McEachern D,et al.BM-1197:a novel and specific Bcl-2/bcl-xl inhibitor inducing complete and long-lasting tumor regression in vivo[J].PLoS One,2014,9(6):e99404.

[7]van Weert S,Bloemena E,van der Waal I,et al.Adenoid cystic carcinoma of the head and neck:a single-center analysis of 105 consecutive cases over a 30-year period[J].Oral Oncol,2013,49(8):824-829.

[8]李曉玲,岳磊,賈志宇，等.Caspase在萊菔硫烷誘導人腺樣囊性癌細胞系ACC-M凋亡中的作用[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志,2015,29(1):20-22,45.

[9]Mignard V,Lalier L,Paris F,et al.Bioactive lipids and the control of Bax pro-apoptotic activity[J].Cell Death Dis,2014,29(5):e1266.

[10]Alibek K,Irving S,Sautbayeva Z,et al.Disruption of Bcl-2 and Bcl-xL by viral proteins as a possible cause of cancer[J].Infect Agent Cancer,2014,23(9):44.

[11]滿瑩，唐國瑤，王萬春，等.口腔扁平苔蘚、白斑及鱗癌組織Bak蛋白表達特點及其與細胞凋亡相關性研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志,2014,28(3):136-142.

[12]賈志宇，趙云轉(zhuǎn)，王維麗,等.萊菔硫烷對頭頸癌細胞系PCI-13中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子1和3的影響[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2013,29(6)：811-815.

(本文編輯：許卓文)

Effect of Bcl-2 family on apoptosis of salivary adenoid cystic carcinoma cell line ACC-M induced by sulforaphane

JIA Zhi-yu1, GUO Tao2, ZHUANG Zhi-zheng3,

YUE Lei1, YANG Wei1, ZHANG Ying-huai1*

(1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050000, China；2. Department of Stomatology, Hebei Chest Hospital,

Shijiazhuang 050041, China；3. Department of Stomatology, Affiliated Hospital

of Hebei University, Baoding 071000, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of sulforaphane(SFN) on expression of Bcl-2 family in salivary adenoid cystic carcinoma cell line ACC-M, and to evaluate the effect of Bcl-2 family on apoptosis of ACC-M cells induced by SFN. MethodsAfter ACC-M cells were treated with 20 or 40 μmol/L SFN for desired time, morphology changes of ACC-M cells were observed with inversion phase contrast microscope, Giemsa staining and transmission electron microscope(TEM). Flow cytometry with Annexin-V-FITC/propidium iodide double staining were used to detect the apoptosis rate of ACC-M. After ACC-M cells were treated with 40 μmol/L SFN for 4, 8, 16 and 24 hours, the expression of Bax, Bak, Bcl-2 and Bcl-xL were detected by Western blot. ResultsImage data showed that SFN could induce apoptosis of ACC-M cells. Flow cytometry data showed that apoptosis rate was increased with time and concentration of SFN. There were significantly different among each groups(P<0.05). Expression of proapoptosis protein Bax and Bak as well as ratio of Bax/Bcl-2 were increased with treating time, whereas that of anti-apoptosis protein Bcl-2 and Bcl-xL were decreased by treatment with 40 μmol/L SFN for 4, 8, 16 and 24 h. There were significantly different among each groups(P<0.05). ConclusionSFN could induce apoptosis of ACC-M cells with time- and concentration-dependent manners, and up-regulate expressions of Bax and Bak, and down-regulate expressions of Bcl-2 and Bcl-xL, which might be the mechanisms for the apoptosis of ACC-M induced by SFN.

[Key words]mouth neoplasms； sulforaphane; apoptosis

[中圖分類號]R39.8

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)02-0161-05

通訊作者*。E-mail：zhyh787@163.com

[作者簡介]賈志宇(1973-)，男，河北武邑人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)

[基金項目]河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20110340；20130150)

[收稿日期]2015-02-02；[修回日期]2015-03-04