董玉瑛，王　翔，鄒學(xué)軍，李曉博

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

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三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪的急慢性毒性分析

董玉瑛，王翔，鄒學(xué)軍，李曉博

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

摘要：采用靜置馴養(yǎng)-暴露方法測(cè)定了東北林蛙蝌蚪在不同質(zhì)量濃度梯度三氯生中的急、慢性毒性，由劑量-效應(yīng)關(guān)系獲得其24 h-LC50和48 h-LC50值分別為1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48 h最大無(wú)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1；進(jìn)一步測(cè)定了蝌蚪暴露在最大無(wú)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度下11 d期間體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶活性動(dòng)力學(xué)變化特征。結(jié)果顯示，暴露2 d時(shí)蝌蚪體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性升高3.5 %，產(chǎn)生了氧化脅迫作用，暴露7 d時(shí)過(guò)氧化氫酶活性升高49.9 %，達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)但仍高于正常值。鑒于三氯生對(duì)蝌蚪的慢性損害和長(zhǎng)期毒性明顯存在，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的綜合影響將不容忽視。

關(guān)鍵詞：三氯生；東北林蛙蝌蚪；急性毒性；亞慢性毒性；過(guò)氧化氫酶活性

抗生素、止疼劑、消毒劑、降脂劑和防腐劑等藥品和個(gè)人護(hù)理品(PPCPs)是與人類(lèi)關(guān)系密切、應(yīng)用廣泛、種類(lèi)繁多的一大類(lèi)新型污染物。由于其全球使用量大，在許多水環(huán)境中被檢測(cè)的頻率高，研究PPCPs對(duì)生物的毒理效應(yīng)成為了重點(diǎn)關(guān)注的方向之一[1-2]。三氯生是一種高效廣譜抗菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌以及病毒均有廣泛高效的殺滅抑制作用，被廣泛應(yīng)用于化妝品、牙膏、香皂等各種清潔衛(wèi)生產(chǎn)品中[3]。目前針對(duì)三氯生的生態(tài)毒性研究主要集中在急性毒性研究，而對(duì)其長(zhǎng)期的生態(tài)毒性和受試生物體內(nèi)酶活的影響研究報(bào)道較少，因此，對(duì)其進(jìn)行亞慢性毒性分析并獲得基礎(chǔ)毒性數(shù)據(jù)對(duì)于制定該類(lèi)化合物的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和安全閾值、評(píng)估水生生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防和處理突發(fā)事件具有重要意義[4]。

兩棲動(dòng)物是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。蛙類(lèi)是一種重要的兩棲動(dòng)物，其幼體蝌蚪對(duì)水環(huán)境變化非常敏感[5-6]，可用于指示水體不同污染程度。本文研究三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪的生態(tài)毒理效應(yīng)，可為該化合物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1　儀器及試劑

CP114型電子天平(奧豪斯儀器廠)；85-2型磁力加熱攪拌器(上海司樂(lè)儀器廠)；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本SHIMADZU CORPORATION)；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

三氯生、30 %冰乙酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液pH=6.4(由4 mol·L-1磷酸二氫鈉和1 mol·L-1磷酸氫二鈉配制而成)、20 mmol·L-1H2O2均為分析純。

1.2　方法

1.2.1東北林蛙蝌蚪馴養(yǎng)及預(yù)實(shí)驗(yàn)

受試生物采集于大連開(kāi)發(fā)區(qū)童牛嶺，經(jīng)鑒定系為東北林蛙蝌蚪。將其置于24 h曝氣后的自來(lái)水中馴養(yǎng)3 d。在暴露實(shí)驗(yàn)前一天不予喂食。以曝氣水為空白對(duì)照，配置不同質(zhì)量濃度梯度的三氯生溶液，按照每升水6尾蝌蚪的比例進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，平行3~5組，實(shí)驗(yàn)期間不投食，記錄24 h和48 h各組蝌蚪的死亡情況，特別觀察零死亡的最大劑量和全部死亡的最小劑量，以便確定正式實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度梯度。

1.2.2三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪急性毒性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)調(diào)整質(zhì)量濃度梯度，并以同樣的投加方式再次進(jìn)行試驗(yàn)，24 h后測(cè)一次蝌蚪死亡數(shù)量，48 h后測(cè)一次蝌蚪死亡數(shù)量，最終可以確定三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪的半數(shù)致死濃度(LC50)。根據(jù)水生生物急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法在預(yù)試驗(yàn)得到的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，按照等間距的方式，設(shè)置三氯生的5組質(zhì)量濃度梯度(0.2，0.5，0.8，1.1，2.0 mg·L-1)對(duì)東北林蛙蝌蚪進(jìn)行染毒。設(shè)空白對(duì)照組與平行試驗(yàn)組，每組中放入8尾蝌蚪，用暴露實(shí)驗(yàn)法，24 h和48 h后紀(jì)錄各組蝌蚪的死亡數(shù)。

1.2.3三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)

選用5周齡以上蝌蚪，三氯生藥品質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1，設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組放置10尾蝌蚪，并設(shè)置去氯曝氣水的空白對(duì)照及平行實(shí)驗(yàn)。分別于0,2,4,7,11,16 d取樣，每組取4尾蝌蚪作為平行，用蒸餾水將其沖洗后迅速擦干，稱(chēng)重并測(cè)量體長(zhǎng)、頭圍，觀察其活動(dòng)狀態(tài)。

1.2.4三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性影響[7-8]

將蝌蚪樣品、0.1 g PVPP和20 mL 0.2mol·L-1的磷酸鹽緩沖液混合于研缽中，在冰浴條件下研磨后轉(zhuǎn)移，以10 000 r·min-1、4℃條件下離心30 min，取上清液置于-80℃保存?zhèn)溆?。?5℃條件下，將3 mL 20 mmol·L-1H2O2和500 μL酶液加入試管中迅速搖勻后，以蒸餾水為參比，測(cè)240 nm下3 min期間的吸光度值，間隔1s讀數(shù)一次。制作混合物的吸光度OD240值隨時(shí)間變化曲線，根據(jù)線性部分計(jì)算每分鐘吸光度變化值△OD240。以每克蝌蚪樣品(鮮重)每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個(gè)過(guò)氧化氫酶活性單位計(jì)算過(guò)氧化氫酶活性，1個(gè)過(guò)氧化氫酶活性單位(U)表示為0.01△OD240/min·mg蛋白質(zhì)。

2結(jié)果與討論

2.1　三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪急性毒性分析

進(jìn)行三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪24 h和48 h急性毒性分析，數(shù)據(jù)擬合結(jié)果如圖1和圖2。計(jì)算獲得24h-LC50為1.578 mg·L-1，48h- LC50為1.102 mg·L-1，折合東北林蛙蝌蚪單位重量對(duì)三氯生的48 h毒性承載力LC50為5 510 mg·kg-1。有研究表明，三氯生對(duì)小鼠口服喂食情況下單位重量的毒性承載力LC50為3 700 mg·kg-1、腹腔注射條件下單位重量的毒性承載力LC50為89 mg·kg-1，并且已對(duì)小鼠具有輕度致畸性，損傷到肌肉功能，引起了肝癌和肝臟纖維化[9]。由此可知，三氯生對(duì)兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的急性毒性效應(yīng)顯著。

圖1　三氯生對(duì)蝌蚪暴露24 h劑量-效應(yīng)關(guān)系

圖2　三氯生對(duì)蝌蚪暴露48 h劑量-效應(yīng)關(guān)系

2.2　三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪發(fā)育體征影響

觀察三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪暴露在最大無(wú)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1溶液中11 d期間亞慢性毒性情況如圖3和圖4，顯示了其對(duì)蝌蚪體長(zhǎng)、頭圍及體重的影響?？瞻讓?duì)照組蝌蚪平均體長(zhǎng)由2.83 cm增長(zhǎng)到3.14 cm，實(shí)驗(yàn)期間尾部逐漸萎縮，16 d后蝌蚪尾部消失變成青蛙；三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組蝌蚪平均體長(zhǎng)基本無(wú)變化，發(fā)育緩慢?？瞻讓?duì)照組蝌蚪平均頭圍由1.86 cm增到2.04 cm；三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組蝌蚪平均頭圍由1.86 cm降到1.66 cm，頭圍明顯變小?？瞻讓?duì)照組蝌蚪平均體重由208.1 mg增到251.1 mg，體重呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)；三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組蝌蚪平均體重由208.1 mg降到112.0 mg，體重顯著減少。三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組蝌蚪在暴露期間7 d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，且存活的蝌蚪活動(dòng)性明顯減弱。

圖3　蝌蚪暴露期間體長(zhǎng)和頭圍的變化情況

圖4　蝌蚪暴露期間體重的變化情況

Nik Veldhoen等人研究了布洛芬對(duì)成長(zhǎng)中的中北美牛蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只要暴露濃度在10-9范圍，即可引起蝌蚪體內(nèi)和體外培養(yǎng)器官的分子反應(yīng)。中北美牛蛙蝌蚪在1 5μg·L-1布洛芬環(huán)境下暴露6 d，可以改變其肝臟中mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程[10]。對(duì)比研究說(shuō)明，布洛芬為內(nèi)服藥物，三氯生多為外用抗菌劑，暴露濃度在10-7范圍中三氯生即可抑制蝌蚪變態(tài)發(fā)育，對(duì)蝌蚪的脅迫性較大。

2.3　三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

進(jìn)行三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪在最大無(wú)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度0.8 mg·L-1下暴露11d期間過(guò)氧化氫酶活性動(dòng)力學(xué)特征的研究，其體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性變化趨勢(shì)見(jiàn)表1。從表1中可以看出，三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性均比空白對(duì)照組高，從第2 d到第7 d，三氯生暴露實(shí)驗(yàn)組的過(guò)氧化氫酶活性升高較快，7 d后酶活性降低；空白對(duì)照組酶活性基本變化不大。無(wú)致死質(zhì)量濃度0.8 mg·L-1三氯生下長(zhǎng)時(shí)間暴露，可促使蝌蚪體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性增強(qiáng)。由于過(guò)氧化氫酶是蝌蚪體內(nèi)重要的生物防御系統(tǒng)酶，三氯生已經(jīng)對(duì)蝌蚪產(chǎn)生了氧化脅迫作用，誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶活性，提高機(jī)體抗氧化能力。因此，蝌蚪體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性增強(qiáng)以后，蝌蚪的防御功能增強(qiáng)，抵抗三氯生的脅迫作用增大。但因?yàn)槿壬拿{迫作用太大，而致使蝌蚪在未能完全變態(tài)發(fā)育前大部分死亡。

表1　三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪過(guò)氧化氫酶活性的影響

呂玥等人研究了壬基酚對(duì)中華大蟾蜍蝌蚪的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明暴露于0.010 mg·L-1壬基酚的蝌蚪，其生長(zhǎng)發(fā)育被極顯著抑制；CAT活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后恢復(fù)；處理組DNA損傷水平均顯著高于對(duì)照組，具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系[11]。綜合對(duì)比上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，三氯生對(duì)兩棲動(dòng)物的體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響同表面活性劑壬基酚相類(lèi)似，都會(huì)誘導(dǎo)其提高，以增強(qiáng)機(jī)體防御機(jī)制。

3結(jié)論

(1) 采用靜置馴養(yǎng)-暴露方法測(cè)定了東北林蛙蝌蚪在三氯生中的急性毒性，由毒性效應(yīng)-劑量相關(guān)關(guān)系，獲得 24h-LC50和48 h-LC50毒性效應(yīng)值分別為1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48h最大無(wú)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1。

(2) 對(duì)蝌蚪長(zhǎng)期低濃度的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明，三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪的體長(zhǎng)、頭圍、體重等體征有明顯的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)周期11 d期間，其平均頭圍縮小了10.7 %，體重減少了46.1 %，體長(zhǎng)變化不明顯，體形變細(xì)，蝌蚪無(wú)法完成變態(tài)發(fā)育。

(3) 三氯生對(duì)東北林蛙蝌蚪體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，三氯生可對(duì)蝌蚪產(chǎn)生氧化脅迫作用，誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶活性增大，以提高機(jī)體抗氧化能力。但當(dāng)三氯生的脅迫作用達(dá)到一定程度，會(huì)致使蝌蚪在未能完全變態(tài)發(fā)育前大部分死亡。

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(責(zé)任編輯鄒永紅)

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《大連民族大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

2016年1月15日

Analysis on Acute and Sub-chronic Toxicity of

Triclosan to the Northeast Frog Tadpoles

DONG Yu-ying，WANG Xiang，ZOU Xue-jun，LI Xiao-bo

(College of Environment and Resource, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Abstract:In this paper the stationary tested method was adopted to determine the acute and chronic toxicity of triclosan to the northeast frog tadpoles which were exposed to different concentration gradient of triclosan. The acute data were obtained by effects-dose relationship. 24h-LC50is 1.578mg·L-1and 48h-LC501.102mg·L-1respectively. The largest no lethal effect concentration of triclosan to the tadpoles is 0.8mg·L-1. By kinetics test of catalase activity it can be found that the enzyme activity increased 3.5% in 2 days, and reached the maxium value beyond the blank value with 49.9% in 7 days to indicate the oxidative stress effect. It should be pay more attention to chronic damage, long-term toxicity and comprehensive impact on the ecological environment.

Key words:triclosan；northeast frog tadpole；acute toxicity；sub-chronic toxicity；catalase activity

中圖分類(lèi)號(hào)：X503.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2096-1383(2016)01-0011-04

作者簡(jiǎn)介：董玉瑛(1968-)，女，遼寧錦州人，教授，博士，學(xué)校優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人，主要從事新型污染物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) (21477001)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC201502070302)。

收稿日期：2015-10-26