史秀云，　張玉彪，　柳云恩，　佟昌慈，　劉學(xué)磊，　施　琳，　劉　穎，　叢培芳，

金紅旭1,2，　高　燕1,2，　侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院　1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和

器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽　110016；

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體外膜肺氧合對撞擊傷致急性肺損傷相關(guān)分子通路影響

史秀云1,2，張玉彪1,2，柳云恩1,2，佟昌慈1,2，劉學(xué)磊1,2，施琳1,2，劉穎1,2，叢培芳1,2，

金紅旭1,2，高燕1,2，侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診科；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和

器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽110016；

摘要：目的探討體外膜肺氧合(ECMO)對實驗犬重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷的治療效果。方法選取20只實驗犬，隨機分為對照組(A組)，模型組(B組)，機械通氣治療組(C組)，ECMO治療組(D組)。將4組實驗犬在無菌條件下取出肺組織，分別用于Western Blot、實時熒光定量PCR和病理學(xué)檢測。結(jié)果B組實驗犬的促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6的表達均升高，經(jīng)過機械性通氣和ECMO治療后，促炎因子的表達量均下降(P<0.05)，炎癥相關(guān)通路因子NF-κB的表達量也明顯降低，說明重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)機制可能與NF-κB通路有關(guān)；凋亡因子Caspase3的表達無明顯差異(P>0.01)；Bax在A組中表達較低，在創(chuàng)傷后表達明顯增高，治療無效果。抑制凋亡因子Bcl-2在A組中表達較高，在B組表達量降低，經(jīng)保護性肺通氣和ECMO治療后表達量相對增高。結(jié)論實驗犬經(jīng)過ECMO治療可改善重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷。

關(guān)鍵詞：體外膜肺氧合(ECMO)；急性肺損傷；炎癥因子；NF-κB信號通路；急危重癥

體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)是一種將體內(nèi)部分靜脈血引流到體外，由驅(qū)動泵將體外經(jīng)ECMO后變?yōu)榈膭用}血液泵入體內(nèi)的一種心肺輔助技術(shù)。ECMO作為一種體外生命支持方式，其本質(zhì)是一種改良的人工心肺機，最重要的部分是血泵和膜肺，分別起人工心和人工肺的作用，為呼吸衰竭和循環(huán)衰竭患者提供更長時間的生命支持[1-2]。當(dāng)患者的肺功能嚴(yán)重受損、治療無效時，ECMO可以代替肺行使氣體交換的功能[3]，為患者的治療與康復(fù)提供更多的時間。另外，當(dāng)患者的心功能嚴(yán)重受損時，ECMO也可以代替心臟泵血功能，維持血液循環(huán)[4]。

當(dāng)機體發(fā)生急性肺損傷(acute lung injury，ALI)時，肺臟在行使通氣和換氣功能的同時，機體通過自身體內(nèi)各種防御機制來減輕有害因子對肺臟的侵害，促使肺臟恢復(fù)肺功能；而隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過人為的干預(yù)可以減少有害因素對肺臟的損傷[5]，肺功能的恢復(fù)過程需要一定的時間，如在這段時間內(nèi)，有其他設(shè)備能代替損傷的肺工作，使其充分“休息”，也許對肺功能的恢復(fù)有一定的幫助，ECMO正是一種起代替肺行使肺功能作用的一種設(shè)備[6-7]。

本研究通過構(gòu)建立犬的撞擊傷致急性肺損傷的動物模型，應(yīng)用Western blot、實時熒光定量PCR技術(shù)和病理學(xué)觀察，探討多種重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷中，傳統(tǒng)機械通氣治療和經(jīng)ECMO治療的區(qū)別，為臨床ECMO救治ALI提供理論基礎(chǔ)，提高救治成功率?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組20只成年健康Beagle犬，體質(zhì)量30～34 kg，隨機分為4組：對照組(A組，n=5)；模型組(B組，n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型；機械通氣組(C組，n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用機械通氣治療；ECMO治療組(D組，n=5)，橡皮彈撞擊至犬肺損傷模型，采用ECMO治療。所有實驗犬均購自于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心，在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，食物及水由動物實驗中心提供。

1.2犬肺損傷模型建立實驗犬標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)2周，術(shù)前12 h禁食不禁水，固定于實驗架上，常溫條件下18.4 mm橡皮彈5 m距離致胸部創(chuàng)傷。橡皮彈全彈重18.47～19.23 g，飛行彈重8.31～8.72 g，彈丸最大直徑18.16～18.83 mm，彈速106～125 m/s，動能(E)為59.73 J，比動能(Es)為21.69 J/cm2。

1.3機械通氣治療實驗犬30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射，麻醉后固定，仰臥在手術(shù)臺上。F6.0～F8.0氣管導(dǎo)管插入并連接呼吸機，呼吸頻率15次/min，F(xiàn)iO2為40%，氧濃度1.00%，潮氣量20 ml/kg。游離右側(cè)股動脈，采集動脈血標(biāo)本，肝素化置管后連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)。游離左側(cè)股靜脈，置管連接三通，連接輸液裝置。氣管插管和Y型管之間連接雙向流量壓力傳感裝置，連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)，測量氣道壓力和流量的改變。在整個實驗過程中注意麻醉深度，適時適量追加戊巴比妥鈉， 0.03%的司可林維持實驗犬肌松，自主呼吸消失為準(zhǔn)。

1.4ECMO治療術(shù)前以1 mg阿托品腹腔注射，30 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉實驗犬至睫反射消失，固定于手術(shù)臺上。F6.0～F8.0氣管插管，連接簡易呼吸器、氧氣罐和氮氣罐，維持實驗犬的呼吸，調(diào)節(jié)氮氣、氧氣的濃度比以降低吸入的氧氣濃度，將置入的熱稀釋導(dǎo)管與有創(chuàng)動脈血氧飽和度監(jiān)測儀和多功能監(jiān)護儀連結(jié)。游離雙側(cè)股動脈、股靜脈及右側(cè)頸靜脈，采用股靜脈-頸靜脈ECMO模式，實驗犬的股靜脈插管和頸內(nèi)靜脈插管與ECMO系統(tǒng)相連，按右股靜脈、儲血器、滾壓泵、氧合器、右頸內(nèi)靜脈的順序連接。激活全血凝固時間(ACT)維持在140～200 s。體外循環(huán)開始時，膜肺氣血比調(diào)至1∶1，氧合器清掃氣流為純氧，流量2～4 L/min。從心排量所能達到的最大值為體外循環(huán)血量開始，轉(zhuǎn)流建立后，給予無氧呼吸(全氮氣)。維持動脈血氧飽和度(SaO2)在90%時的體外循環(huán)血流量。

1.5肺組織標(biāo)本采集依據(jù)《善待實驗動物的相關(guān)措施》的方法處死實驗犬，無菌條件下取出肺組織。取部分肺上葉置入EP管中，置入液氮罐中，并保存于-80 ℃冰箱待用。

1.6檢測方法

1.6.1總蛋白提取及定量方法將凍存在液氮中的肺組織取出后融化，加入RIPA裂解液后制備成組織勻漿，取上層蛋白溶液，測定其蛋白的濃度，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2Western blot方法配制10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜，加入一抗GADPH(Santa)、IL-1b(Abcam)、IL-4(Abcam)、IL-6(Abcam)、IL-10(Abcam)、TNF-α(Abcam)、NF-kB(Abcam)、Caspase3(Santa)、Bax(Santa)、Bcl-2(Santa)4°C雜交過夜，二抗孵育，增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6.3肺組織RNA的提取及cDNA的合成方法取適量的組織移入研缽中，加入液氮將組織研碎，其余步驟按Trizol試劑操作說明書進行。RNA沉淀干燥后，加入DEPC水溶解。根據(jù)cDNA Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA。

1.6.4Real Time-PCR檢測方法應(yīng)用SYBR Green實時熒光定量PCR法，以GAPDH為參比基因，對GADPH、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、NF-кB、Caspase3、Bax、Bcl-2進行實時熒光定量分析，計算各目的基因/內(nèi)參基因的相對定量。見表1。

表1　各基因引物序列

1.6.5病理學(xué)檢測方法取出經(jīng)10%甲醛固定的肺組織標(biāo)本，石蠟包埋并制作切片，進行HE染色，光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)的變化。

2結(jié)果

2.1Western blot檢測結(jié)果通過Western blot實驗檢測，結(jié)果顯示4種炎癥相關(guān)因子IL-1b、IL-4、IL-6和IL-10在B組表達量均明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)治療后，C組保護性肺通氣治療和D組ECMO治療中其表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤壞死因子TNF-α的表達量無明顯變化。檢測炎癥相關(guān)通路因子NF-κB結(jié)果顯示，B組表達量明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組保護性肺通氣治療和D組ECMO治療經(jīng)治療后表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。檢測凋亡相關(guān)因子結(jié)果顯示，凋亡因子Caspase3的表達無明顯差異，而Bax在A組中表達較低，在創(chuàng)傷后表達有所增高。抑制凋亡因子Bcl-2在A組中表達較高，在B組表達量降低，經(jīng)保護性肺通氣和ECMO治療后表達量相對增高。見圖1。

圖1　4組實驗犬肺組織中相關(guān)蛋白表達

2.2mRNA檢測結(jié)果通過Real Time PCR實驗檢測，結(jié)果顯示炎癥相關(guān)因子IL-1b、IL-4、IL-6和IL-10的表達水平與Western blot結(jié)果相一致。B組模型組表達量明顯高于A組對照組，C組保護性肺通氣治療和D組ECMO治療經(jīng)治療后4種炎癥相關(guān)因子表達量明顯降低。促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6和抑制炎癥因子IL-10創(chuàng)傷后表達升高。腫瘤壞死因子TNF-α的表達量無明顯變化。B組模型組NF-κB表達量明顯高于A組對照組，C組保護性肺通氣治療和D組ECMO治療經(jīng)治療后表達量明顯降低。凋亡因子Caspase3的表達無明顯差異，Bax在A組對照組中表達較低，在創(chuàng)傷后表達明顯增高。抑制凋亡因子Bcl-2在A組對照組中表達較高，在B組模型組表達量降低，經(jīng)保護性肺通氣和ECMO治療后表達量相對增高。見表2。

2.3組織學(xué)觀察結(jié)果HE染色下，A組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁未見損傷；B組肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡壁可見明顯的損傷，有淤血，可見明顯的紅細胞浸潤；C組保護性肺通氣治療后，肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度輕度緩解，淤血和紅細胞浸潤較B組輕但仍然嚴(yán)重；D組ECMO治療后，肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度明顯減輕，輕度紅細胞滲出。

表2　mRNA Real Time PCR相對表達量

注：與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05

3討論

ALI是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，易轉(zhuǎn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，最終可能發(fā)展成多器官障礙綜合征(MODS)。到目前為止，ALI及ARDS的發(fā)病機制尚不明確，尚無明確的治療方法[8-9]。ALI的病理變化主要為肺組織微血管通透性增高，炎癥細胞浸潤，并伴有肺間質(zhì)纖維化，肺水腫；其病理生理學(xué)的變化主要為肺通氣和肺換氣功能受損[10-11]。傳統(tǒng)的治療方法為機械性通氣，但其治療效果欠佳。

20世紀(jì)60年代初，ECMO被用于體外循環(huán)以來，主要應(yīng)用于心、肺功能的支持治療,改善低氧血癥。二十世紀(jì)七十年代初，Hill等[12]應(yīng)用 ECMO成功救治ALI患者。1975年，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)評估ECMO治療成人ALI的療效，由于該研究的設(shè)計和管理存在問題，研究結(jié)果很不理想[13]。因此，關(guān)于ECMO治療ALI的研究一度被中斷。但之后有研究人員發(fā)現(xiàn)ECMO治療ALI的有價值的報道[14-15]。1993年，北京阜外醫(yī)院龍村等[16]用ECMO 成功救治了ALI患者。Hemmila等[17]對1989-2003年使用ECMO治療的ALI患者進行分析，結(jié)果顯示，其實際生存率遠高于預(yù)期生存率。2009年，Peek等[18-19]研究ECMO治療成人ALI，患者的存活率與機械性通氣相比明顯提高10個百分點。本研究通過建立實驗犬肺損傷的模型，利用蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR、病理學(xué)染色等技術(shù)探討傳統(tǒng)的機械性肺通氣和ECMO治療組之間的區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)，Western blot實驗中，模型組的促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6創(chuàng)傷后表達升高，經(jīng)過治療后表達有所改善說明ECMO治療可以改善重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)，但抑制炎癥因子IL-10的表達趨勢與促炎因子相同的原因需要進一步的研究驗證。C組保護性肺通氣治療和D組ECMO治療后，NF-kB的表達量明顯降低，說明重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的急性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)機制可能與NF-kB通路相關(guān)。凋亡因子Caspase3和Bax治療前后表達差異不明顯，而抑制凋亡因子Bcl-2在A組對照組中表達較高，在B組模型組表達量降低，經(jīng)治療后表達量顯著增高，說明ECMO治療對重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致肺細胞凋亡的保護作用可能和Bcl-2通路有關(guān)。實時熒光定量PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果基本相同，更進一步的從基因表達的水平上確證了ECMO治療對重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致急性肺損傷的保護作用。病理學(xué)檢查中，肺大體觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肺挫裂傷，可見明顯的淤血，經(jīng)保護性肺通氣治療和ECMO治療后，肺部損傷、肋骨骨折、肺挫裂傷、血氣胸和淤血均明顯緩和；HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，紅細胞浸潤，在經(jīng)過保護性肺通氣治療和ECMO治療后淤血和紅細胞浸潤均較模型組輕，但和正常對照組相比較仍然較嚴(yán)重，這些結(jié)果表明經(jīng)過ECMO治療可改善重癥創(chuàng)傷導(dǎo)致的實驗犬急性肺損傷。

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·論著·

第一作者：史秀云(1991-)，女，遼寧鐵嶺人，技師，碩士

Molecular mechanism of extracorporeal membrane oxygenation on the expression of cytokines in acute lung injury induced by impact injury

SHI Xiu-yun,ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,TONG Chang-ci,LIU Xue-lie,SHI Lin,CONG Pei-fang,LIU Ying,JIN Hong-xu,GAO Yan,HOU Ming-xiao(Department of Emergency Medicine,and Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) on acute lung injury.MethodsForty dogs were randomly divided into four groups:Group A,the control group;Group B,acute lung injury group;Group C:mechanical ventilation group;Group D:ECMO group.The lungs were removed under the aseptic condition from dogs of the four groups,and Western blot,Real-Time PCR,Pathological changes of lung tissue for HE staining were observed.ResultsPro-inflammatory cytokines of IL-1b,IL-4,IL-6 in Group B increased when compared with those in Group A.After mechanical ventilation and ECMO treatment,pro-inflammatory cytokines decreased(P<0.05).Inflammatory pathways factor NF-κB expression also significantly decreased.Description of acute lung injury caused by inflammation might be associated with NF-κBpathway.There were no statistically significant difference among Caspase3,Bax and Bcl-2(P>0.01).ConclusionECMO can improve lung function effectively on acute lung injury.

Key words:Extracorporeal membrane oxygenation;Acute lung injury;Inflammatory cytokines;NF-κB pathway;Emergency and severe disease

收稿日期：2015-08-30

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.01.03

文章編號：2095-5561(2016)01-0010-05

中圖分類號：TH 777

文獻標(biāo)志碼：A

通信作者：侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

基金項目：2012年遼寧省科技攻關(guān) (201122007)；2012年全軍“十二五”面上項目(CSY12J002)；2013年全軍“十二五”面上延續(xù)項目(CSY13J003)