段　松

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·論著·

前列腺癌組織中Skp2的表達及其與前列腺癌術后復發(fā)的關系

段松

[摘要]目的研究S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)在前列腺癌患者中的表達及其與前列腺癌術后復發(fā)的關系。方法選擇2010年6月-2012年6月接受手術的前列腺癌86例作為觀察組，同時選取良性前列腺增生25例作為對照組，檢測兩組前列腺組織中Skp2的mRNA水平和Skp2蛋白的表達，根據(jù)Skp2表達情況將觀察組分為陽性組和陰性組，分析Skp2表達與臨床病理特征及術后復發(fā)的關系。結(jié)果與對照組相比，觀察組前列腺癌組織中Skp2 mRNA和Skp2蛋白的表達均顯著升高(P<0.05)。觀察組Skp2陰性35例的1、2、3年復發(fā)率為8.57%、25.71%、31.43%，顯著低于Skp2陽性51例的27.45%、39.22%、49.02%(P<0.05)；Skp2陰性患者1、2、3年生存率分別為97.14%、91.43%、82.86%，顯著高于Skp2陽性患者的90.19%、84.31%、70.59%(P<0.05)。結(jié)論前列腺癌組織中Skp2 mRNA和Skp2蛋白的高水平表達與前列腺癌組織分型、臨床分期、腫瘤浸潤程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關系，可能是前列腺癌發(fā)展的重要機制之一。

[關鍵詞]前列腺癌；S期激酶相關蛋白2；復發(fā)率；生存率

作者單位：404000重慶,重慶三峽中心醫(yī)院病理科

引用格式：段松.前列腺癌組織中Skp2的表達及其與前列腺癌術后復發(fā)的關系[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):47-50.

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，老年男性中常見，在世界癌癥總發(fā)病數(shù)中約占十分之一，全世界每年約有20萬患者死于前列腺癌[1-2]。我國前列腺癌發(fā)病年齡在55歲左右，發(fā)病率隨著年齡的增長而增長，嚴重影響了老年男性的生活質(zhì)量和預期壽命[3]。目前手術治療是前列腺癌治療的主要方法，臨床顯示，早期前列腺癌行根治術患者的五年相對生存率達到99%，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為腫瘤發(fā)展的中晚期，錯失手術治療的最佳時機[4]。我國前列腺癌的平均五年生存率僅為53.8%[5-6]。因此，闡明前列腺的發(fā)生發(fā)展機制對早期診斷、早期治療及預后判斷起著重要的作用。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)是DNA復制所必需的人類F-box蛋白家族的一員，在泛素蛋白酶降解途徑中起特異性識別蛋白底物的作用，參與抑癌蛋白的降解、細胞周期調(diào)控及細胞增生與凋亡的調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后關系密切，具有潛在的診斷和治療價值[7-9]。本研究探討Skp2在前列腺癌患者中的表達及其與前列腺癌術后復發(fā)的關系，旨在為前列腺癌的臨床診斷和治療提供幫助。

1資料與方法

隨機選取2010年6月-2012年6月在我院接受手術的并經(jīng)臨床和病理確診為前列腺癌的86例作為觀察組，取其前列腺癌手術切除組織用于本研究?；颊吣挲g58～76(70.03±14.21)歲,均為初治者,術前未經(jīng)內(nèi)分泌治療、化療、放療、生物免疫治療及其他相關抗腫瘤治療,所有病例均無合并其他惡性腫瘤。取同期經(jīng)手術切除并由臨床和病理確診為良性前列腺增生的25例的組織作為對照組，患者年齡55～75(68.79±13.45)歲。兩組患者年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.1儀器與試劑總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京唯贊生物有限公司；兔抗人Skp2多克隆抗體購自美國Santa公司；HRP標記羊抗鼠IgG二抗、GAPDH內(nèi)參等均購自北京中杉金橋生物有限公司；C1000 RT-PCR擴增儀購自美國BIO-RAD公司;PSA檢測試劑盒由鄭州博賽生物技術研究所提供。

1.2實驗方法

1.2.1RT-PCR檢測Skp2 mRNA水平根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書對兩組標本的總RNA進行提取，按照RT-PCR試劑盒說明書將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank提供的Skp2 mRNA序列，設計如下引物(上海生工生物有限公司)：Skp2-F：5′-ATGTGACTGGTCGGTT-3′；Skp2-R:5′-TCGATA￣G￣G￣T￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣G￣C￣T￣-￣3￣′￣;￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣:￣5￣′￣-￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣T￣T￣T￣G￣-￣3￣′￣;￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣:￣5￣′￣-￣A￣G￣G￣G￣G￣C￣C￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣T￣C￣T￣T￣C￣-￣3￣′￣。￣對￣引￣物￣特￣異￣性￣和￣退火溫度進行條件優(yōu)化后制備以下反應體系：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10 μL，上游/下游引物(10 μmmol/L)各0.6 μL，1∶100稀釋后的cDNA 8.8 μL。總反應體積20 μL。30 ℃水浴10 min；96 ℃，預變性2 min，1個循環(huán)；96 ℃，變性30 s；56 ℃，退火30s；72 ℃，延伸2 min；共35個循環(huán)；最后72 ℃總延伸6 min，于PCR儀上讀取數(shù)據(jù)。

1.2.2免疫組化檢測Skp2蛋白水平兩組標本離體后經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，石蠟包埋，作 4 μm切片。在55 ℃烤箱中烘烤1 h；依次進行脫蠟、水化；按說明書操作，采用DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封固。

1.2.3免疫組化評定標準每個組織標本隨機選取6個視野，根據(jù)細胞核的染色情況進行陽性率判斷。染色強度分標準：無色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。陽性細胞數(shù)：1%～10%視為1分；1l%～50%視為2分；51%～75%視為3分；>75%視為4分。兩者得分相乘，以總分4分為分界點，因Skp2表達與患者預后相關，由此將<4分者定義為Skp2陰性，≥4分者為Skp2陽性[10]。

1.2.4PSA濃度測定陰性和陽性組患者均于手術前3 d清晨空腹采靜脈血 3 mL，離心收集血清測定血清PSA的濃度，嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5臨床及病理學特征分析腫瘤穿透前列腺包膜和淋巴轉(zhuǎn)移參照NCCN前列腺癌臨床實踐指南亞洲共識(V2.2013版)的評定標準進行[11]：腫瘤穿透前列腺包膜33例，淋巴轉(zhuǎn)移42例。腫瘤分期根據(jù)Jewett-Whitmore-Prout 方案評價：A期8例、B期28例、C期31例、D期19例。按照已有文獻報道[12]進行PSA分組，術前血清前列腺特異抗原(PSA)值<4 μg/L者 13例,4~10 μg/L者18例, >10 μg/L者55例?；颊叱鲈汉蠖ㄆ谶M行檢查，根據(jù)患者臨床癥狀、體征、相應的檢查(CT掃描和病理檢查等)及淋巴結(jié)檢測判斷患者是否出現(xiàn)復發(fā)或者轉(zhuǎn)移。對于患者的預后采用術后復發(fā)率和1、2、3年生存率進行評定。

2結(jié)果

2.1兩組Skp2 mRNA的表達觀察組Skp2 mRNA表達水平明顯高于對照組(圖1，P<0.05)。

與對照組比較，*P<0.05圖1　兩組組織標本Skp2 mRNA水平比較

2.2兩組Skp2蛋白表達的比較Skp2蛋白主要表達于前列腺癌細胞的細胞核中，在正常前列腺組織中其表達水平極低甚至不表達(圖2A)，在腫瘤細胞中表達水平顯著增加(圖2B)。觀察組前列腺腫瘤組織中Skp2蛋白表達水平明顯高于對照組的良性前列腺增生(圖3，P<0.05)。

A：對照組前列腺組織；B：觀察組前列腺組織圖2　兩組組織中Skp2蛋白的表達

與對照組比較，*P<0.05圖3　兩組Skp2蛋白分析結(jié)果比較

2.3觀察組中Skp2水平與臨床病理特征的相關觀察組中35例Skp2蛋白表達為陰性，51例為Skp2蛋白表達陽性。表1顯示觀察組Skp2蛋白陽性表達與臨床病理特征具有明顯的相關性，觀察組中Skp2蛋白陽性表達與前列腺癌術前PSA水平(>10 μg/L)、腫瘤穿透前列腺被膜(有)、淋巴轉(zhuǎn)移(有)呈密切正相關(r分別為0.540、0.610、0.528，均P<0.05), 而與組織分化程度(低分化)，腫瘤分期(C+D)呈負相關(r分別為-0.478、-0.513，均P<0.05)。

2.4不同Skp2蛋白表達的患者術后復發(fā)、生存率比較兩組患者治療后均回訪3年以上，Skp2陰性患者共11例復發(fā)；Skp2陽性患者共25例復發(fā)。Skp2陰性患者1、2和3年的復發(fā)率分別為8.57%(3例)、25.71%(9例)、31.43%(11例)；Skp2陽性患者的1、2和3年的復發(fā)率分別為27.45%(14例)、39.22%(20例)、49.02%(25例)，兩組復發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Skp2陰性患者1、2、3年生存率分別為97.14%(34例)、91.43%(32例)、82.86%(29例)，Skp2陽性患者1、2、3年生存率分別為90.19%(46例)、84.31%(43例)、70.59%(36例)，Skp2陰性患者1、2、3年生存率顯著高于Skp2陽性患者(P<0.05)。

表1　觀察組Skp2蛋白的表達與臨床病理

3討論

前列腺癌為老年男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中僅次于膀胱腫瘤和腎腫瘤的惡性腫瘤，且逐漸呈低齡化[13],在中國的一些經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)其發(fā)病率在逐年攀升。前列腺癌患者的預后情況根據(jù)腫瘤的臨床分期和病理分級亦呈現(xiàn)多種變化[14],臨床希望能尋找前列腺癌的特異性分子標記物來幫助解決目前所遇到的困境。

Skp2是1995年Demetrick等通過熒光原位雜交技術發(fā)現(xiàn)的一個與細胞周期密切相關的基因，因其能與S期激酶CyclinA-CDK1相互作用而得名，分子量45KD，因此又稱為P45蛋白，屬于原癌蛋白[15-16]。Skp2作為一種DNA復制所必需的F-box蛋白，是人類SCF復合物中行使特異性識別底物功能的組分，參與泛素依賴性蛋白水解途徑，調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的含量，從而調(diào)控細胞周期及細胞的增殖和凋亡[17]。Skp2蛋白主要在細胞核中表達,在細胞核中Skp2的過表達與細胞周期激酶抑制劑(CDKi)p27蛋白的低表達密切相關，使受損的細胞由G1期過渡到S期，該過程與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關[18-19]。Bochis等[20]通過對結(jié)腸癌中Skp2表達水平的分析發(fā)現(xiàn)，Skp2表達水平與結(jié)腸癌的不良預后密切相關，Skp2高表達患者，其預后較差， Skp2可作為結(jié)腸癌一個重要的獨立預后指標，并可能成為結(jié)直腸癌的一個有前途的治療目標。另外有研究發(fā)現(xiàn)，Skp2的高表達和p27的低表達與多種腫瘤呈正相關關系。Zheng等[21]通過分析雌激素受體表達不同的乳腺癌患者中Skp2和p27的表達，發(fā)現(xiàn)在雌激素受體陰性的乳腺癌患者中Skp2通常高表達，且患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較高，Skp2高表達與p27低表達高度相關。

本研究進一步探討了前列腺癌組織中Skp2的表達及臨床意義，對比分析前列腺癌組織和良性前列腺組織，結(jié)果顯示前列腺癌組織中Skp2 mRNA表達水平明顯高于良性前列腺組織，提示前列腺癌組織中Skp2基因的轉(zhuǎn)錄處于激活狀態(tài)。進一步分析Skp2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中Skp2蛋白的表達也明顯高于良性前列腺組織，并與Skp2 mRNA的表達一致，這一結(jié)果與Wei等[22]的研究結(jié)果相同。此外，結(jié)果還顯示Skp2蛋白的表達與患者臨床病理特征如血清PSA水平、臨床分期、組織分型、浸潤程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在一定關系，提示Skp2蛋白與前列腺癌患者的術后復發(fā)和生存存在聯(lián)系。本文亦通過隨訪分析了Skp2蛋白不同表達水平的前列腺癌患者術后復發(fā)和生存情況，結(jié)果顯示Skp2蛋白表達陽性患者術后1、2、3年的復發(fā)率明顯高于陰性者，而生存率則明顯低于陰性者，說明Skp2蛋白的表達水平與前列腺癌患者術后復發(fā)和生存存在密切聯(lián)系。綜上所述，Skp2在前列腺癌組織中的表達異常，與患者臨床病理特征和預后關系密切，對后期治療與判斷預后有一定幫助。

【參考文獻】

[1]Kelly BD, Miller N, Sweeney KJ, et al. A circulating microRNA signature as a biomarker for prostate cancer in a high risk group[J]. J Clin Med. 2015,4(7):1369-1379.

[2]Gohil K. Exciting therapies ahead in prostate cancer[J].P T, 2015,40(8):530-531.

[3]Singh P, Pal SK, Alex A, et al. Development of PROSTVAC immunotherapy in prostate cancer[J]. Future Oncol, 2015,11(15):2137-2148.

[4]Abuadas MH, Petro-Nustas W, Albikawi ZF. Predictors of participation in prostate cancer screening among older men in Jordan[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16(13):5377-5383.

[5]Bashir MN.Epidemiology ofprostate cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015, 16(13):5137-5141.

[6]Ersekerci E, Sofikerim M, Taheri S, et al.Genetic polymorphism in sex hormone metabolism and prostate cancer risk[J].Genet Mol Res, 2015,14(3):7326-7334.

[7]Yang WR, Wang Y, Wang Y, et al. mTOR is involved in 17β-estradiol-induced, cultured immature boar sertoli cell proliferation via regulating the expression of Skp2, CCND1, and CCNE1[J]. MolReprod Dev, 2015, 82(4):305-314.

[8]王琦, 蔣敬庭, 吳昌平. Skp2在前列腺癌中的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述. 2011, 17(7):1004-1007.

[9]Moro L, Arbini AA, Marra E, et al.Up-regulation of Skp2 after prostate cancer cell adhesion to basement membranes results in BRCA2 degradation and cell proliferation[J]. J Biol Chem, 2006, 281(31):22100-22107.

[10]張振宇, 張宇鋒, 張宏偉. Sox2在人前列腺癌中的表達及其臨床意義[J]. 國際腫瘤學雜志，2014,41(11): 875-878.

[11]葉定偉，顧成元，朱耀. NCCN前列腺癌臨床實踐指南亞洲共識(V2.2013版)要點解讀與分析[J]. 中華外科雜志, 2015, 53(1): 63-57.

[12]徐葉青，郭劍明，朱延軍, 等. 不同PSA水平的國人首次前列腺穿刺活檢所需穿刺針數(shù)的研究[J].腫瘤防治研究, 2014, 41(2):124-127.

[13]夏維木, 劉定益, 周文龍, 等. 新輔助治療后RT-PCR對前列腺癌盆腔淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的診斷價值[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2012,14(5): 399-401.

[14]翟金盛, 王曉玲, 王穎. 前列腺癌患者社會支持和抑郁狀況調(diào)查及相關性分析[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2015,17(1): 67-69..

[15]Chan CH, Morrow JK, Zhang S, et al. Skp2: a dream target in the coming age of cancer therapy[J]. Cell Cycle, 2014, 13(5):679-680.

[16]Cheng H, Meng J, Wang G, et al.Skp2 regulates subcellular localization of PPARγ by MEK signaling pathways in human breast cancer[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(8):16554-16569.

[17]Wang Z, Gao D, Fukushima H, et al.Skp2: a novel potential therapeutic target for prostate cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1825(1):11-17.

[18]Shapira M, Ben-Izhak O, Slotky M, et al. Expression of the ubiquitin ligase subunit cyclin kinase subunit 1 and its relationship to S-phase kinase protein 2 and p27Kip1 in prostate cancer[J]. J Urol, 2006, 176(5):2285-2289.

[19]邢岳, 王紓宜, 許祖德. Skp2在鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義[J]. 復旦學報(醫(yī)學版), 2014, 41(1): 60-65.

[20]Bochis OV, Irimie A, Pichler M, et al. The role of Skp2 and its substrate CDKN1B (p27) in colorectal cancer[J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2015, 24(2):225-234.

[21]Zheng WQ, Zheng JM, Ma R, et al.Relationship between levels of Skp2 and P27 in breast carcinomas and possible role of Skp2 as targeted therapy[J]. Steroids, 2005, 70(11): 770-774.

[22]Wei S, Chu PC, Chuang HC, et al. Targeting the oncogenic E3 ligase Skp2 in prostate and breast cancer cells with a novel energy restriction-mimetic agent[J]. PLoS One, 2012, 7(10):e47298.

(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

The expression of Skp2 in prostate cancer and its relationship with postoperative recurrence

DUANSong.

DepartmentofPathological,theThreeGorgesCentralHospitalofChongqing，Chongqing404000,China

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of Skp2 in prostate cancer and its relationship with the recurrence of prostate cancer. Methods86 cases of patients diagnosed with prostate cancer and received operation in our hospital from June 2010 to June 2012 were randomly selected as observation group. At the same time, 25 cases patients with benign prostatic hyperplasia were selected as control group. Skp2 mRNA level in the two groups were determined by real-time quantitative PCR. Skp2 protein level was analyzed by immunohistochemistry. According to Skp2 level, 86 cases of patients were divided into Skp2 positive group and Skp2 negative group. The relationship between Skp2 protein level and clinical pathological features and postoperative recurrence in Skp2 positive group and Skp2 negative group were analyzed. ResultsCompared with the control group, Skp2 mRNA and protein levels in the prostate cancer tissues of the observation group increased significantly (P<0.05). 1, 2 and 3 year cumulative recurrence rate in the Skp2 negative patients were 8.57%, 25.71 and 31.43%, while 27.45%, 39.22% and 49.02% in Skp2 positive patients. The cumulative recurrence rate of Skp2 protein-negative patients was significantly lower than that of Skp2 positive patients (P<0.05). 1, 2 and 3 year cumulative survival rate in the Skp2 protein-negative patients were 97.14%, 91.43% and 82.86%, while 90.19%, 84.31% and 70.59% in Skp2 positive patients. The cumulative survival rate of Skp2 protein-negative patients was significantly higher than that of Skp2 positive patients (P<0.05). ConclusionThe high expression of Skp2 mRNA and protein in prostate cancer tissues are closely related to types, clinical stage, tumor invasion and lymph node metastasis of prostate cancer, which may be one of the important mechanism of prostate cancer development.

[Key words]prostate cancer; Skp2; recurrence rate; survival rate

(收稿日期：2015-08-24；修回日期：2015-11-23)

[中圖分類號]R737.25

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.014