楊麗婷 綜述，劉　森 審校

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·綜述·

KaiB調控藍藻生物鐘振蕩的分子機制

楊麗婷 綜述，劉森 審校

[摘要]藍藻PCC7942的基因簇KaiABC編碼的KaiA、KaiB及KaiC蛋白對單細胞藍藻的生物節(jié)律非常重要。藍藻翻譯后生物鐘是受一系列生物化學反應控制的，其中包括磷酸化反應、ATP水解、單體的交換以及各種分子構象的變化，從而維持了生物振蕩的準確與精密。本文對近些年來KaiB在翻譯后振蕩體系中參與Kai蛋白的相互作用而共同調節(jié)生物振蕩，對ATP酶的影響及誘導KaiC單體的交換等一系列過程進行了綜述，并介紹了KaiB與信號輸出蛋白SasA的競爭關系，這對揭示體外生物鐘的工作機制有著非常重要的意義。

[關鍵詞]KaiB蛋白；磷酸化循環(huán)反應；單體的交換；ATP酶活性；SasA

作者單位：443002湖北宜昌，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，三峽大學醫(yī)學院

引用格式：楊麗婷,劉森.KaiB調控藍藻生物鐘振蕩的分子機制[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):68-72.

生物節(jié)律現(xiàn)象廣泛存在于生物界，而且越來越多的研究報道顯示：無論是原核單細胞有機體、高等動植物還是人類的許多生理代謝活動都是在生物鐘控制下進行的。藍藻是已知的具有晝夜節(jié)律生物鐘的最簡單模式生物，為闡明晝夜節(jié)律的基本分子機制帶來很大便利，其KaiA、KaiB及KaiC三種核心蛋白維持的生物振蕩，不依賴于DNA轉錄水平與RNA翻譯水平調控的轉錄/翻譯負反饋回路(Transcriptional/Translational Feedback Loop, TTFL)，稱為翻譯后振蕩(Post-Translational Oscillation，PTO)[1]。更為重要的是，KaiA/KaiB/KaiC體系是目前唯一能在體外重組的、翻譯后振蕩的生物鐘體系，并且生物鐘所具有的自我維持性、周期性及溫度補償性都可以由KaiA、KaiB、KaiC及ATP在試管條件下重現(xiàn)[2]。因此，該體系對于體外研究蛋白質相互作用網(wǎng)絡模式具有重要意義，對理解晝夜節(jié)律振蕩器的形成機制也具有重要價值。本文對近些年來KaiB在振蕩體系中參與Kai蛋白的相互作用而共同調節(jié)生物振蕩，KaiB對ATP酶的影響及誘導KaiC單體的交換等一系列過程進行了綜述，并介紹了KaiB與信號輸出蛋白SasA的競爭關系，這對揭示體外生物鐘的工作機制有著非常重要的意義。

1KaiABC生物節(jié)律簡介

藍藻生物鐘基因是一個由KaiA、KaiB及KaiC基因組成的基因簇KaiABC，其中KaiA單獨轉錄，KaiB、KaiC共同轉錄，它們的表達產(chǎn)物KaiA、KaiB及KaiC蛋白共同組成生物鐘的中央振蕩器，產(chǎn)生晝夜節(jié)律的計時機制。具體表現(xiàn)有：基因簇轉錄水平呈高低的節(jié)律性變化，KaiC蛋白磷酸化水平高低的節(jié)律性變化。在轉錄水平，KaiA蛋白會增加KaiB與KaiC的轉錄，同時其產(chǎn)物KaiC蛋白會抑制KaiA基因的表達，一旦KaiA基因的表達受抑制，KaiA蛋白量會下降，KaiB與KaiC的轉錄效率也隨之下降，即KaiB與KaiC的轉錄水平呈現(xiàn)出節(jié)律性。在蛋白水平，核心蛋白KaiC同時具有自激酶(Autokinase)和自磷酸酶(Autophosphatase)的活性，自激酶活性的存在，使KaiC能夠在自身亞基間相互磷酸化；而自磷酸酶活性則使磷酸化的KaiC能夠自動去磷酸化，這兩種酶活性的存在使KaiC發(fā)生磷酸化-去磷酸化周期性變化具備了可能性[3]。KaiA蛋白通過促進KaiC蛋白的磷酸化與抑制KaiC蛋白的去磷酸化，提高KaiC的磷酸化水平，而KaiB是KaiC磷酸化的負調控因子，能降低由KaiA增強的KaiC的磷酸化水平，使KaiC自身去磷酸化，在KaiA與KaiB的共同作用下，KaiC從整體上表現(xiàn)出磷酸化和去磷酸化的周期性振蕩[4]。

Kai蛋白與其他生物鐘蛋白沒有相似性，只要破壞這三種蛋白中的任何一種就將會使生物節(jié)律紊亂，而KaiC蛋白的生物化學性質是了解生物鐘特性的關鍵。KaiC蛋白的功能形式是由六個單體聚合而成的同源六聚體，每個單體有兩個亞基，即N端的CI亞基與C端的CII亞基，每個CII亞基有431位的絲氨酸(S431)殘基和432位的蘇氨酸(T432)殘基兩個磷酸化位點。因此，每個KaiC單體就有四種可能的磷酸化狀態(tài)，分別呈現(xiàn)出不同的功能。具體的表現(xiàn)為為KaiC磷酸化/去磷酸化循環(huán)的四個步驟：a. T432的磷酸化；b. S431的磷酸化；c. T432的去磷酸化；d. S431的去磷酸化(圖1)。這2個磷酸化位點的磷酸化和去磷酸化嚴格按照上面的順序進行，形成一個精密的時間記錄元件，單向記錄時間的流逝[5]。

磷酸化時相，在KaiA的作用下，處于低磷酸化狀態(tài)的KaiC(TS)先T432的磷酸化(pTS)，然后 S431的磷酸化(pTpS)；去磷酸化時相，在KaiA與KaiB共同作用下，處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC(pTpS)先T432的去磷酸化(TpS)，然后 S431的去磷酸化，KaiC回到低磷酸化狀態(tài)(TS)，一個循環(huán)結束，新的循環(huán)開始圖1　KaiC的磷酸化/去磷酸化循環(huán)

2Kai蛋白的結合位點

目前已經(jīng)證實KaiA有兩個結合位點，在磷酸化時相與去磷酸化時相分別與KaiCII的A-Loop結構域[6]和KaiB[7]相互作用。KaiA二聚體對低磷酸化的KaiC的親和力高于處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC[8]，當KaiC的CII亞基處于低磷酸化狀態(tài)時，KaiA通過結合C端的A-loop(488-497位)，增強KaiC的自激酶的活性同時減弱磷酸酶的活性，加速其向高磷酸化狀態(tài)的轉變，從而促進KaiC磷酸化反應。而KaiB則選擇性的結合到處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC上，通過抑制KaiA的活性，從而使KaiC在磷酸酶的優(yōu)勢活性下，向低磷酸化狀態(tài)轉變[9]。定向標記的電子自旋共振分析表明KaiA-KaiB有瞬間的相互作用。電子自旋磁共振顯示KaiA的C端與KaiB相互作用，而KaiA的N端對KaiA-KaiB的相互作用不是必需的。進一步研究顯示，KaiA缺失1-179位就不能與KaiB相互作用[6]，所以KaiA連接N端與C端的連接區(qū)域(147-170位)，對KaiA-KaiB的相互作用非常重要。進一步研究顯示KaiC的N端能夠增強ΔNKaiA-KaiB(ΔNKaiA為KaiA缺失1-135位)的相互作用[10]。

KaiB的主要作用是結合磷酸化狀態(tài)的KaiC，阻止KaiA與KaiC的相互作用，從而促進KaiC向去磷酸化狀態(tài)轉變，但KaiB與KaiC相互作用區(qū)域迄今尚不明確。電鏡、小角散射實驗表明KaiB是和KaiC的CII亞基結合的，那么KaiB最可能是通過結合在KaiC的CII亞基端，直接占據(jù)KaiA的結合位點，或形成空間位阻，來影響KaiA與KaiC的結合；Villarreal等[11]的研究，較好地支持KaiB-KaiC相互作用發(fā)生在CII端的ATP溝槽。Chang等[12]利用NMR實驗表明KaiB和KaiC反應發(fā)生在CI亞基由一些非極性氨基酸及帶負電的氨基酸殘基組成的B-loop(116-123位)，但具體的作用區(qū)域目前還不明確，且存在爭議。一般情況下，KaiB是不能結合到KaiC的CI亞基上的，因為這個結合位點是隱藏的。但是當CI亞基和CII亞基之間有堆積力的作用，使CI亞基構象發(fā)生變化，暴露出KaiB結合位點時，KaiB才能結合上去[12]。這說明KaiB有也可能結合在CI亞基來調節(jié)KaiC的磷酸化程度。

綜上所述，KaiB可能結合在KaiC的CI亞基和CII亞基。如果KaiB結合在CII亞基上則主要可能是通過直接影響CII亞基的表面靜電勢(electrostatic surface potential，ESP)調節(jié)KaiC的運行，也有可能是阻礙KaiA與KaiC的結合位點來調節(jié)KaiC的振蕩，還有可能是調節(jié)ATP與KaiC的反應來調節(jié)KaiABC的正常運行。如果KaiB結合在CI亞基上，則可能是從KaiC的結構穩(wěn)定性方面來間接調節(jié)KaiABC反應。雖然KaiB與KaiC的具體結合位點存在爭議，但是KaiB的結合都可以占領或影響KaiA與KaiC的結合，來實現(xiàn)使KaiC從高磷酸化狀態(tài)向低磷酸化狀態(tài)的轉變[13]。

3KaiB結合KaiC時的聚合形式

KaiB是三種蛋白中最小的一個，結構類似于硫氧還蛋白折疊的二聚體或四聚體，單體由102個氨基酸組成。KaiB蛋白會發(fā)生自身相互作用而形成二聚體、四聚體甚至多聚體。最近的研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘蛋白KaiB不具有自激酶活性，但可以與KaiC直接發(fā)生相互作用而參與生物鐘的調控，并且KaiB的不同的聚合形式之間的平衡和轉化，對核心振蕩器的節(jié)律性有影響[14]。那么，KaiB究竟以何種形式與KaiC結合的呢？

基于以前的研究我們認為KaiB是以穩(wěn)定的同源四聚體存在，但它的四聚體不能與KaiA或KaiC相互作用，只有當聚合物解聚后才有此功能。KaiA就是通過加速KaiB四聚體的解離，從而促進KaiB與KaiC的結合。同樣的方法，KaiC促進KaiB與KaiA的相互作用。已經(jīng)有研究顯示，KaiB是以二聚體的形式結合到CII亞基上的，KaiB二聚體與CII亞基的頂端相互作用形成三層夾心的結構[15]。Heck等用質譜的手段發(fā)現(xiàn)在與KaiC的結合過程中，KaiB的單體、二聚體、四聚體等形式都有參與，他們指出KaiB單體是和KaiC發(fā)生反應的基本單位，而且不排除KaiB能和KaiC的CI亞基、CII亞基都發(fā)生反應[16]。因此，KaiB的單體、二聚體和四聚體形式的動態(tài)變化，可能與KaiC的磷酸化振蕩息息相關。而KaiB的尾端可能通過影響單體-二聚體-四聚體的平衡而影響其聚合狀態(tài)，然而只有二聚體與KaiC發(fā)生相互作用，不同時期可能KaiB有不同的聚合體形式和KaiC發(fā)生相互作用[17]。我們通過構建不同的共價連接寡聚體的策略，研究了KaiA和KaiB蛋白的共價二聚體的功能，初步發(fā)現(xiàn)共價連接的蛋白對KaiC的振蕩現(xiàn)象產(chǎn)生了很大影響，反映出寡聚體間動態(tài)轉變對該振蕩體系正常功能的重要性。相信對KaiA/KaiB/KaiC核心振蕩體系的分子機制的進一步闡明，將有助于我們對蛋白質相互作用網(wǎng)絡、生物振蕩器以及高等生物晝夜節(jié)律現(xiàn)象等的深入理解。

4KaiB影響ATP酶的活性及誘導KaiC單體的交換

除了KaiC的磷酸循環(huán)，ATP的結合也是藍藻生物計時機制的一個重要的生物過程。ATP的主要功能是為該體系提供能量、維持KaiC的六聚體功能狀態(tài)以及為KaiC的磷酸化提供磷酸基團參與KaiC的磷酸化振蕩。而KaiB通過影響ATP的結合而間接的影響到該體系的能量供給及KaiC功能六聚體的形成，從而阻礙KaiC的磷酸化循環(huán)的正常運行。

此外，KaiC是一個特殊的ATP酶，并且這種ATP酶的活性也呈現(xiàn)節(jié)律性與溫度補償效應，而且這種活性似乎還決定著KaiA/KaiB/KaiC振蕩體系周期的長短：活性越高，周期越短；活性越低，周期越長[18]。KaiC上的ATP酶的活性主要受KaiB與KaiA調控，與KaiC所處的磷酸化狀態(tài)無關[19]。KaiC的ATP酶和磷酸酶的活性是相互交融的。由于CI亞基結構的特殊性，只有ATP酶活性，且較穩(wěn)定。如果KaiB與CI亞基結合則會影響CI亞基上的ATP酶活性，從而影響KaiC的磷酸化振蕩[10]。此外，KaiB可能通過結合到KaiC的CII亞基ATP結合槽上，影響ATP的結合，從而來調節(jié)KaiC磷酸化振蕩。當KaiC達到一定的磷酸化程度后，其CII亞基的激酶活性由于KaiB對ATP結合槽的影響而轉向為ATP合成酶活性和ATP水解酶活性，從而進入去磷酸化相位[20]。因此，從一定意義上可以說，KaiB是KaiABC磷酸化振蕩體系的核心調節(jié)元件，該調控受到ATP結合比例的影響。

另外，KaiB通過影響ATP的結合誘導KaiC單體的交換。很多實驗都證實在KaiC的磷酸化循環(huán)過程中，KaiC六聚體與單體及另外的KaiC六聚體會發(fā)生亞基的交換，即KaiC六聚體存在不斷的解聚與再聚合過程[5]。研究表明，任何狀態(tài)的KaiC單體都可以和六聚體的KaiC中的單體發(fā)生交換，從而改變六聚體KaiC的磷酸化水平[21]，這對維持較高的振蕩振幅是非常重要的。KaiC的CII結構域ESP在處于低磷酸化狀態(tài)時是帶正電的，在轉向高磷酸化狀態(tài)時分子表面就會累積負電荷；KaiB的C末端富含酸性氨基酸，而ATP是該區(qū)域中唯一一個與KaiB尾巴帶有相同電性的分子。因此，KaiB很有可能定向的與KaiC相互作用而將其聚合體分離為單體及干擾ATP的結合。如果KaiB將它的尾巴插入到KaiC的兩個亞基之間，ATP的結合位點就會被破壞，從而減弱亞基之間的相互作用，最終導致亞基的分離甚至是促成他們之間的交換[22]。因此，KaiB除了抑制KaiA的功能，還可能用它帶負電荷的C末端減弱KaiCII亞基的相互作用及減弱ATP酶的活性甚至是替換ATP。KaiC的CI亞基與CII亞基以及這兩個亞基的相互作用，對這種酶活性的轉變起關鍵作用[23]。綜上所述，KaiB可以通過影響ATP的結合、影響ATP酶的活性及誘導KaiC單體的交換而間接的調控KaiC的磷酸化振蕩(圖2)。

圖2　KaiB調控KaiC的磷酸化振蕩

5KaiB與SasA競爭KaiCII同一結合位點

信號輸出蛋白SasA，是組氨酸激酶感受器，最初的研究表明SasA與KaiC有相互作用，并且該作用發(fā)生在SasA的N端結構域(1-97位)，進一步的研究又發(fā)現(xiàn)他們的相互作用也是有節(jié)律性的。SasA-KaiC復合物的SAXS和EM的綜合結果顯示，兩個SasA的N端結合在KaiCII上KaiB的結合位點上，并且對之后KaiC的磷酸化狀態(tài)敏感。非變性PAGE膠顯示：SasA與KaiB都不結合KaiCI；SasA與KaiB 兩種蛋白競爭性的結合到KaiCII結構域上；SasA結合KaiC比KaiB結合KaiC更緊密。簡言之就是SasA與KaiB競爭性的結合到KaiCII結構域上，這個結論就可以很好的解釋在KaiB的活性被抑制的時候，SasA可以替代KaiB與KaiC發(fā)生相互作用[24]。綜上所述，SasA[25]與KaiB[12]都結合到KaiCII結構域上，并且KaiB與SasA競爭同一結合位點B-Loop。

N-SasA與KaiB有很大一段相似序列，它可以與KaiC直接相互作用。進一步研究表明SasA與KaiB有許多相似的特性，其中包括ESP，但是N-SasA水溶液的核磁(NMR)圖顯示N-SasA與KaiB有很重要的不同點。SasA與KaiB的一個顯著的不同就是SasA單體就可以感知KaiC的磷酸化狀態(tài)，但目前沒有充足的證據(jù)證明KaiB也是以單體的形式結合到KaiC上的。另外，SasA與KaiB的C末端尾巴有很大的不同，KaiB的C末端顯著性的特征是富含酸性殘基的氨基酸，而SasA的C末端作為二聚體的連接子沒有這一特征[22]。KaiB只能結合到S431殘基磷酸化狀態(tài)的KaiC上[26]，而SasA能夠結合任何磷酸化狀態(tài)的KaiC[27]，但是KaiB能替換處于任何磷酸化狀態(tài)的KaiC上結合的SasA[14]。KaiC的N端直接與SasA相互作用接受時間信號，并促進SasA的磷酸化循環(huán)然后將磷酸基團轉移給轉錄因子RpaA，RpaA磷酸化而被激活[28]。在主觀黑暗條件下，KaiB-KaiC復合物激活CikA，從而誘導RpaA的去磷酸化而被抑制[29]。因此，KaiB-KaiC結合的節(jié)律可以通過調控隨后對RpaA具有相反作用的SasA與CikA而調控生物鐘信號的輸出。

6結語

生物鐘是生物適應環(huán)境周期性變化的一種內(nèi)在機制，具有調控代謝、生理穩(wěn)態(tài)、睡眠及衰老等重要的生理功能，生物鐘的紊亂會嚴重影響健康或生存。近年來，陸續(xù)有研究證明了生物節(jié)律紊亂與皮膚病、心血管疾病及癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展存在著密切關系。生物鐘研究以同時考察時間和空間四維尺度的方式來研究生命現(xiàn)象的節(jié)律性動態(tài)變化，可以更為準確地揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律及內(nèi)在機制。藍藻生物鐘體系是目前已知最簡單的生物鐘體系，但機制又非常復雜，雖然經(jīng)過近30年的研究，僅就KaiB仍有諸多未解決的問題：KaiB與KaiC的具體結合部位，結合形式，結合狀態(tài)等都存在一些爭議，有些觀點甚至截然相反。KaiB與KaiC的相互作用對磷酸化時相轉向去磷酸化時相有非常重要的意義，但是目前其中的機制研究仍不清楚。對Kai復合物的研究顯示，KaiB存在單體、二聚體及四聚體，但是KaiB的結合模式，相互作用的化學計量以及確切的結合表面仍存在諸多疑點。對于這些問題的解決，有待更多的實驗數(shù)據(jù)的出現(xiàn)。通過對這些生物機制深入、系統(tǒng)的研究，為人們更好的適應生存環(huán)境提供了科學合理的指導，同時也為相關疾病的研究奠定了理論基礎。

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(本文編輯：張仲書)

(收稿日期：2015-11-08；修回日期：2015-12-08)

通訊作者：劉森，E-mail: senliu.ctgu@gmail.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21103098)

[中圖分類號]Q6，Q7

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.021