黃智勇 王立雅 謝春雨 陳亞軍 陳艷 高松城 傅學文 余秋鋒 邱雪芳

[摘要] 目的 探討精子DNA碎片指數（DFI）對體外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠結局的預測價值。 方法 選取2014年12月～2015年5月在本中心接受IVF-ET治療的208對不孕夫婦作為研究對象，按照WHO標準，采用改良精子染色質擴散實驗（SCD）對男方進行精子DFI檢測，并根據精子DFI值將上述IVF-ET患者分為低DFI（<30%）組和高DFI（≥30%）組，分析各組的受精率、正常受精率、可利用胚胎率、優(yōu)質胚胎形成率、優(yōu)質胚胎移植率和妊娠結局。 結果 低DFI組與高DFI組的可利用胚胎率、優(yōu)質胚胎形成率和優(yōu)質胚胎移植率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。低DFI組的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著高于高DFI組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05）。 結論 精子DFI與胚胎質量無關，其可影響IVF受精率和臨床妊娠率。精子DFI檢測可以作為精液質量的檢測指標對體外受精結局進行預測。

[關鍵詞] 精子DNA碎片指數；體外受精-胚胎移植；妊娠結局

[中圖分類號] R711.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（a）-0097-03

Study of sperm DNA fragmentation index on predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization-embryo transplantation

HUANG Zhi-yong WANG Li-ya XIE Chun-yu CHEN Ya-jun CHEN Yan GAO Song-cheng FU Xue-wen YU Qiu-feng QIU Xue-fang

Center for Reproductive Medicine，Maternal and Child Health Care Hospital of Shaoguan City in Guangdong Province，Shaoguan 512026，China

[Abstract] Objective To explore the predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization （IVF）-embryo transplantation （ET） by sperm DNA fragmentation index （DFI）. Methods 208 pairs of infertile couples accepted the IVF-ET treatment in our center from May 2015 to December 2014 were selected as the research object，according to World Health Organization （WHO） standard，sperm DFI was tested by modified sperm chromatin dispersion （SCD） test.The above mentioned participants were divided into the low DFI group （<30%） and the high DFI group （≥30%） based on the value of sperm DFI.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization，the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，the transplantation rate of embryo in high quality and pregnancy outcome in two groups was analyzed. Results There was no significant difference in the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，or the transplantation rate of embryo in high quality between the low DFI group and the high DFI group （P>0.05）.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization and the clinical pregnancy rate in the low DFI group was higher than that in the high DFI group，with significant difference （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Sperm DFI is not related with embryo quality，which can influence on IVF fertilization rate and clinical pregnancy rate.Sperm DFI detection can be considered as inspection index of semen quality used for prediction of IVF outcome.

[Key words] Sperm DNA fragmentation index；In vitro fertilization-embryo transplantation；Pregnancy outcome

目前，不明原因的受精失敗時有發(fā)生，除卵子的因素外，精子也起到至關重要的作用。精液常規(guī)已不能很好地評估精子的情況，因此，對于精子DNA碎片的研究也逐漸升溫。20世紀以來，隨著我國工業(yè)化程度的提高，環(huán)境污染的逐漸加重、人精神壓力的不斷增大以及過多地接觸一些化學物質均可能損傷男性精子。本研究選取在本中心進行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET）助孕治療的男性精液標本作為研究對象，檢測其精子DNA碎片指數（DNA fragmentation index，DFI），并分析DFI與受精率、正常受精率、可利用胚胎率、優(yōu)質胚胎形成率、優(yōu)質胚胎移植率和臨床妊娠率之間的關系，探討DFI對于預測IVF-ET妊娠結局的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年12月～2015年5月在本中心采用長方案超排卵治療、IVF助孕的208對不孕夫婦作為研究對象。為排除女方因素的影響，有以下情況者不屬于本研究范圍：①女方年齡>40歲；②FSH>15 mIU/ml；③取卵<5個；④內膜厚度<7 mm。對男方精液進行DFI檢測，按結果分為低DFI（<30%）組和高DFI（≥30%）組。

1.2 超排方案

采用常規(guī)長方案，于月經周期第19天或第20天開始，肌內注射促性腺激素釋放激素激動劑（注射用醋酸曲普瑞林，天津博福-益普生制藥有限公司）1.00～1.25 mg/次；14 d后檢測血清檢促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH），達到降調標準后開始加用人絕經期促性腺激素（HMG或麗申寶，珠海麗珠制藥）112.5～225.0 U，肌內注射8～12 d，當主導卵泡直徑達到18 mm時肌內注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠制藥）8000～10000 U，36～38 h取卵。

1.3 精液采集和處理

男方禁欲3～5 d，在取卵當日以手淫法收集精液，立即放置于37℃的恒溫平臺上，待精液完全液化后進行分析。采用密度梯度離心法+上游法對精液進行處理，取處理后的精液懸液采用精子染色質擴散法（SCD）檢測DFI（精子DNA碎片檢測試劑盒，深圳華康生物科技有限公司）。密度梯度離心法：將樣品離心沉降，分離。上游法：利用活動精子具有游過液體界面進入不同培養(yǎng)液的能力，分離活力強的精子與死精子、凝集精子、畸形精子、白細胞及雜質。SCD步驟：①室溫20～28℃，試劑盒室溫下平衡30～60 min；②將低熔點瓊脂糖管（含140 μl低熔點瓊脂糖溶液）放入90～100℃水浴，至瓊脂糖凝膠完全熔解，放置于37℃水浴箱至溫度恒定；③采用精子稀釋液將精子密度調至5×106～10×106個/ml，取60 μl加入低熔點瓊脂糖管中，混勻；④取上述懸浮液30 μl滴入預處理載玻片，輕蓋蓋玻片，避免產生氣泡，置于2～8℃冰箱4 min，整個過程要保持載玻片水平位置；⑤取出載玻片，移走蓋玻片，迅速浸入變性液中7 min；取出后放入蒸餾水中浸泡5 s，然后取出載玻片并豎立，濾紙吸干水珠，要注意勿接觸標本區(qū)域，載浸入裂解液中反應20 min；⑥反應畢，浸入洗滌液3 min，洗掉裂解液，再依次浸入70%、90%、無水乙醇溶液中脫水各2 min，自然晾干，瑞氏染色劑染色.染色后，蒸餾水沖洗10～15次，除去多余染色劑，風干，常規(guī)顯微鏡下觀察。

1.4 受精、胚胎觀察和移植

取卵當日常規(guī)進行IVF，受精后16～18 h進行觀察，2PN（原核）為正常受精胚胎，0PN、1PN和≥3PN為異常受精胚胎。受精后48 h觀察胚胎情況，卵裂球為6～8個，細胞大小均勻或基本均勻，無空泡，碎片≤20%判定為優(yōu)質胚胎。根據患者的情況選擇1～3枚胚胎進行移植，移植后14 d測定血清β-HCG，以確定生化妊娠；移植后28 d檢查到宮腔內妊娠囊確診為臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

低DIF組有179個取卵周期，移植周期150個。高DIF組有29個取卵周期，移植周期25個。低DFI組的胚胎率、優(yōu)質胚胎形成率和優(yōu)質胚胎移植率與高DFI組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。低DFI組的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著高于高DFI組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或<0.05）（表1）。

3 討論

據調查，全世界育齡夫婦中，15%存在不育問題，其中8%～22%完全歸因于男性，21%～38%與夫婦雙方有關[1]。精子DNA完整性不僅會嚴重影響到精子的受精能力，導致受精后原核的形成，還可能導致流產、后代先天畸形或者某些遺傳性疾病。對于輔助生殖技術助孕患者而言，精子DFI是影響助孕成功的不利因素之一，因此，檢測精子DNA的完整性對不育患者精子質量的評估具有重要價值[2]。已有研究[3]顯示，精子DNA碎片在輔助生殖技術領域中仍顯示出巨大的預測價值。精液質量決定著受孕的成功率及胎兒質量，不育癥患者的精子DNA損傷程度較生育男子顯著增高。

有研究采用末端轉移酶標記（TUNEL）技術法進行檢測，結果顯示，精子DFI與ART受精率之間存在負相關，提示精子頂體酶活性以及精子穿透透明帶并與卵黃膜融合的能力可能會隨著精子DNA碎片的增加而降低，進而影響精子的受精能力[4-5]，而使用連續(xù)順序追蹤超聲檢查法檢測的數據則則顯示無顯著相關性[6]。關于胚胎質量是否受影響的爭論也十分激烈，因為精子DNA損傷影響胚胎質量的機制還不甚明了，比較認同的觀點是精子染色質的異常導致胚胎質量下降[6]。但是通常情況下精子DNA是在著床前胚胎發(fā)育的后期才開始表達，因此有學者認為精子DNA可能對胚胎質量影響不大[7]。

Benchaib等[8]認為，精子DNA損傷與體外受精受孕率和胚胎質量呈負相關，通過精子DNA碎片可預測IVF的成功率。Velez等[9]也發(fā)現(xiàn)精子DNA斷裂率與受精率呈負相關，并指出其閾值為18%，胚胎質量與精子DNA損傷有關，但認為臨床妊娠及分娩率與DNA損傷之間并無相關性[10]。本研究結果顯示，常規(guī)IVF-ET中，DFI≥30%的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著低于DFI<30%者，而可利用胚胎率、優(yōu)質胚胎率和優(yōu)質胚胎移植率比較，差異無統(tǒng)計學意義。有研究[11]顯示，染色質異常的精子比正常精子更難以結合并穿過透明帶，進入卵子后，染色質去致密化過程出現(xiàn)障礙，妨礙雄性原核的形成。黃茜等[12]的研究顯示，精子DFI≥40%組的精子正常形態(tài)率、頂體完整率均顯著降低。鄭九嘉等[13]認為，精子遺傳物質受到破壞后可能影響相應蛋白的轉錄或合成，進而影響頂體酶原的生成，或者由于無法合成某種酶原激活物質，使頂體酶無法被激活，最終表現(xiàn)為頂體酶活性降低，從而影響受精，因此，精子DNA損傷可能是導致受精失敗的重要原因。本研究中，可利用胚胎率、優(yōu)質胚胎形成率和優(yōu)質胚胎移植率組間差異無統(tǒng)計學意義的原因可能在于通過前期的受精過程已經將有嚴重DNA損傷的精子進行了自然淘汰，輕微損傷的精子受精后卵母細胞可以對其DNA進行修復[14-16]；而兩組臨床妊娠率的差異有統(tǒng)計學意義提示精子DFI檢測可以預測IVF-ET的妊娠結局。

綜上所述，精子DNA損傷影響IVF中的受精率和正常受精率，其與胚胎質量無關，但可以預測IVF-ET的妊娠結局。其作為男性生育力評價的補充指標，有必要在行IVF-ET治療的患者中常規(guī)開展精子DFI檢查。

[參考文獻]

[1] 郭應祿，胡禮泉.男科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：1-24，937-969，1623-1631.

[2] 白曉紅，糜若然.精子DNA碎片化檢測對男性不育診治的價值[J].國外醫(yī)學·計劃生育/生殖健康分冊，2007，26（5）：261-263.

[3] Lopes S，Sun JG，Jurisicova A，et al.Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection[J].Fertil Steril，1998，69（3）：528-532.

[4] Bakos HW，Thompson JG，F(xiàn)eil D，et a1.Sperm DNA damage is associated with assisted reproductive technology pregnancy[J].Int J Androl，2008，31（5）：518-526.

[5] 秦文松，劉英，段金良.精子DNA碎片指數與精液參數的相關性研究[J].中國性科學，2014，23（4）：55-57.

[6] Tomsu M，Sharma V，Miller D.Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters[J].Hum Reprod，2002，17（7）：1856-1862.

[7] Frydman N，Prisant N，Hesters L，et al.Adequate ovarian follicular status does not prevent the decrease in pregnancy rates associated with high sperm DNA fragmentation[J].Fertil Steril，2008，89（1）：93-98.

[8] Benchaib M，Lornage J，Mazoyer C，et al.Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as a prognostic indicator of assisted reproductive technology outcome[J].Fertil Steril，2007，87（1）：93-100.

[9] Velez de la Calle JF，Muller A，Walschaerts M，et al.Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as assessed by the sperm chromatin dispersion test in assisted reproductive technology programs：results of a large prospective multicenter study[J].Fertil Steril，2008，90（5）：1792-1799.

[10] 曾蘭，葉飛，李運星，等.精子DNA完整性與精液常規(guī)參數相關性分析[J].中國計劃生育和婦產科，2014，6（4）：47-50.

[11] Liu DY，Baker HW.Human sperm bound to the zona pellucida have normal nuclear chromatin as assessed by acridine orange fluorescence[J].Hum Reprod，2007，22（6）：1597-1602.

[12] 黃茜，丘映，史秋雯，等.精子DNA損傷與精子形態(tài)、頂體完整率的關系研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（6）：649-650.

[13] 鄭九嘉，楊旭，張李雅，等.精子DNA損傷、核蛋白組型轉換與頂體酶活性及精液參數的相關性分析[J].中華男科學雜志，2012，18（10）：925-929.

[14] 瞿虎，江春強，汪中揚，等.精子DNA碎片率與形態(tài)學及輔助生殖結局的相關性分析研究[J].中國醫(yī)藥指南，2015，13（13）：1-3.

[15] 曾玖芝，龔衍，梁梅玉，等.精子DNA損傷對常規(guī)體外受精-胚胎移植結局的影響[J].中國計劃生育和婦產科，2015，7（5）：30-33.

[16] 陳亮，徐陽.精子DNA碎片化檢測在男性生殖領域的臨床應用[J].中國男科學雜志，2014，29（7）：60-62.

（收稿日期：2015-10-15 本文編輯：祁海文）