蔣莉娟+++皮勝玲++方鐵錚+++姚江雄++++許招懂++++林麗美

[摘要] 目的 建立香附藥材HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計量手段，對多批次藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。 方法 以Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm；柱溫25℃，對10批藥材樣品進(jìn)行相似度分析、聚類分析和主成分分析。 結(jié)果 建立了香附藥材專屬性的HPLC指紋圖譜，標(biāo)示了16個共有指紋峰，10批樣品分為3大類。 結(jié)論 將HPLC指紋圖譜與化學(xué)計量手段相結(jié)合，可有效對香附藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價，為提高其整體質(zhì)量控制提供參考。

[關(guān)鍵詞] 香附；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度評價；聚類分析；主成分分析

[中圖分類號] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）01（a）-0004-04

S 香附為莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的干燥根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效，用于治療肝郁氣滯所致的胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳房脹痛、脾胃氣滯、脘腹痞悶、脹滿疼痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)之癥，為婦科常用藥[1]。《本草綱目》稱之為“氣病之總司，女科之主帥”，主產(chǎn)于山東、浙江、湖南、河南等地，以山東為道地藥材。香附主要含揮發(fā)油類成分，此外還有萜類、黃酮類、酚類、生物堿等化合物[2]。現(xiàn)代藥理研究顯示，香附具有抗炎、抗血小板、降血糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗過敏等作用[3]。指紋圖譜是基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識，借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，是實現(xiàn)鑒別中藥真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點[4]。本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對10批香附藥材進(jìn)行研究并建立指紋圖譜，旨在為香附藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-100B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；T-214型電子分析天平（Denver公司）；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器（Waters公司）。

1.2 材料

甲醇（Honeywell公司，色譜純）；水為超純水（實驗室制備）。α-香附酮對照品（批號：110748200507）購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。10份不同批次或產(chǎn)地的香附藥材樣品均由廣州星群（藥業(yè)）股份有限公司提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室王智老師鑒定為莎草科植物莎草的干燥根莖，具體信息見表1。

表1 香附藥材樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B）為流動相系統(tǒng)梯度洗脫（0～45 min，40%→80%A；45～60 min，80%A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取α-香附酮對照品適量，加甲醇溶解定容至10 ml，得到濃度為0.0261 mg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取香附藥材粉末（過60目篩）約1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 ml，密塞，稱重，超聲處理（功率160 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批（XG140501）藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜。以7號峰的保留時間和峰面積為參照，計算樣品中所含16個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間的RSD為0.003%～0.130%，相對峰面積的RSD為0.15%～2.10%，提示儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批（20111201）藥材粉末，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜?？疾鞓悠分兴?6個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.48%，相對峰面積的RSD為0.01%～2.77%，提示方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取1份（20111201）藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、15、24 h測定指紋圖譜，考察樣品中所含16個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD為0.10%～0.63%，相對峰面積的RSD為0.33%～2.74%，提示香附藥材樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜共有模式的建立 取10批藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，記錄HPLC色譜圖（圖1）。采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0版）進(jìn)行分析，生成共有模式指紋圖譜（圖2），其中以峰7為參照物，其余各共有峰與峰7的相對保留時間與相對峰面積見表2、表3。

2.5.2 共有峰的確定 10批香附生成的對照指紋圖譜標(biāo)定了16個共有峰，具體見圖2。對照品溶液的色譜圖見圖3，經(jīng)與對照品對照，指認(rèn)15號峰為α-香附酮。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價 上述10批香附藥材相似度計算結(jié)果依次為0.999、0.988、0.966、0.996、0.981、 0.771、0.997、0.913、0.996、0.975，除批次為20111201的香附藥材相似度為0.771外，其余批次相似度均>0.9，提示香附藥材樣品具有良好相似性。

2.6 聚類分析

將10批香附藥材HPLC指紋圖譜中16個色譜峰的峰面積與樣品號建立矩陣，導(dǎo)入SPSS軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離的平方為測度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到香附藥材的聚類分析圖（圖4）。結(jié)果顯示，10批樣品可分為三大類，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9聚為一類，S5、S10分別單獨聚為一類。聚類結(jié)果顯示，藥材各批次間成分總體差異較小。

2.7 主成分分析

采用SPSS軟件對10批香附藥材樣品進(jìn)行主成分分析，具體見圖5。結(jié)果顯示，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9集中分布在一個區(qū)域，各樣品相互之間距離較近；S5、S10與其他樣品相距較遠(yuǎn)，樣品可分為3大類。該圖直接反映了各批次樣品之間的差異大小，與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗比較了245、254、265、300和320 nm波長下的色譜圖[5-9]，結(jié)果在254 nm檢測條件下出峰較多，各峰吸收均勻，峰形較好，故選擇254 nm作為檢測波長。本實驗考察了乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸水不同流動相體系[10-14]，結(jié)果顯示甲醇-水能對樣品中各成分實現(xiàn)較好的分離，因此流動相組成選擇甲醇-水；還考察了25、30、35℃柱溫條件下各色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示，不同柱溫下色譜峰略有區(qū)別，當(dāng)溫度升高時，部分峰發(fā)生相對位移與合并，使分離度降低，因此選擇柱溫25℃；此外，本實驗比較了Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）、LiChrospher■100 RP-18 endcapped（5 μm）Hibar■RT 250-4.6、Athena C18120A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4種不同型號的色譜柱，結(jié)果顯示，Kromasil柱各色譜峰的分離度、峰形較其他色譜柱好，因此本實驗選擇Kromasil色譜柱。

3.2 提取方法的考察

本實驗分別對提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時間（15、30、45、60 min）及提取體積（10、20、25、30 ml）進(jìn)行了考察[15-18]，基于出峰數(shù)目和峰面積最終選用甲醇超聲提取30 min，提取體積10 ml，該方法提取較為完全，提取效率最高。

3.3 相似度結(jié)果分析

10批不同批次或產(chǎn)地的香附藥材HPLC指紋圖譜相似度較高，除批次20111201的香附藥材相似度為0.771外，其余批次的相似度均>0.9，提示藥材主要成分構(gòu)成基本一致，藥材質(zhì)量穩(wěn)定。主成分分析與聚類分析的結(jié)果相互佐證，結(jié)果一致，藥材樣品可聚為三類，S3和S10與其他樣品相距較遠(yuǎn)，提示三類藥材質(zhì)量存在一定差異。

3.4 實驗結(jié)果分析

不同批次或產(chǎn)地的香附藥材HPLC指紋圖譜既有共性又存在差異，主要色譜峰的整體面貌基本一致，但各峰峰面積有所不同，這說明環(huán)境因素會對藥材質(zhì)量產(chǎn)生一定影響，是否與生長環(huán)境、土壤條件等因素有關(guān)有待進(jìn)一步考察[19-21]。本實驗應(yīng)用指紋圖譜和聚類分析、主成分分析相結(jié)合的方法進(jìn)行研究，能夠更全面、準(zhǔn)確地判別藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，可有效用于香附藥材的質(zhì)量控制與鑒定。

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（收稿日期：2015-08-12 本文編輯：祁海文）