張淋筌,吳 鵬,曹交歡,馬 駿,劉 杰,周纖纖,張堅松
(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院應(yīng)用生理研究室,長沙 410006)
葛根素對支氣管哮喘療效的實驗研究
張淋筌#,吳 鵬#,曹交歡,馬 駿,劉 杰,周纖纖,張堅松
(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院應(yīng)用生理研究室,長沙 410006)
目的:觀察葛根素對支氣管哮喘的治療作用,探討其初步治療機制。方法:建立臭氧應(yīng)激支氣管哮喘大鼠模型,按低、中、高劑量對大鼠進(jìn)行灌藥,觀察大鼠生理活動狀況;并進(jìn)行肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)和肺部氣道組織切片觀察,統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)。結(jié)果:葛根素能顯著減弱大鼠哮喘癥狀,減少肺部炎癥細(xì)胞浸潤,也可介導(dǎo)氣道正常修復(fù),修復(fù)程度與給藥劑量水平成正相關(guān)。結(jié)論:葛根素對支氣管哮喘有較好的治療效果,其機制可能與抗氣道炎癥和調(diào)節(jié)凝血平衡紊亂有關(guān)。
葛根素;支氣管哮喘;SD大鼠;慢性炎癥
葛根素(8-β-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮)是中藥葛根中提取出的主要的大豆異黃酮成分[1,2]。葛根素具有抗炎[3,4]、抗氧化[5,6]、心血管保護(hù)[7,8]等作用,常用來作為抗炎藥物使用,同時有改善凝血的特性以及心梗后膽堿能神經(jīng)功能恢復(fù)的功能[9],廣泛應(yīng)用于臨床心腦血管系統(tǒng)疾?。?0]。然而對于葛根素治療支氣管哮喘的療效記載相對不是很充分,正因為如此,對葛根素的具體治療支氣管哮喘的療效需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的實驗進(jìn)一步加以確認(rèn)。本研究通過建立臭氧應(yīng)激支氣管哮喘大鼠模型,分析葛根素對支氣管哮喘的療效及相關(guān)機制
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物健康SD大鼠60只,體重220±20g,由湖南天勤生物技術(shù)有限公司提供。
1.1.2 實驗主要試劑及器材99%葛根素(干粉),地塞米松溶液(1mg/mL),生理鹽水,4% 甲醛溶液,酒精,25%烏拉坦,二甲苯,HE染色試劑盒,石蠟,加拿大樹膠;熔蠟箱,離心管,小紙盒,切片機,冷凍臺,包埋機,恒溫箱,冰箱,病理圖像分析儀,臭氧發(fā)生器。
1.2 試驗方法
1.2.1 分組與模型建立將60只SD大鼠分為六組(每組10只),正常組:采用生理鹽水進(jìn)行灌注,不作其他處理;病理模型組:按照本室已有的方法[11]對大鼠進(jìn)行臭氧應(yīng)激1h/d,連續(xù)進(jìn)行8d,每天應(yīng)激完畢后觀察大鼠生理活動狀態(tài)。葛根素低、中、高濃度組,均采取病理模型組相同處理的基礎(chǔ)上,按100mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)對低濃度組灌藥+1ml生理鹽水腹腔注射,中濃度組灌2倍劑量,高濃度組灌3倍劑量;DEX組灌1ml生理鹽水+1mL地塞米松(0.5mg/kg)腹腔注射。
1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvage lavage fluid,BALF)中細(xì)胞分類計數(shù)取大鼠一只,稱重后腹腔注射25%烏拉坦麻醉仰臥固定,行胸腔打開手術(shù),剪除胸骨暴露心臟,從心尖處抽干外周血致死。分離出頸部氣管,在氣管下段作一小T形切口,將氣管插管緩緩插入,進(jìn)程中如遇輕微阻力,表明插管到達(dá)氣管隆突部位,向左旋轉(zhuǎn)插管,稍用力后即可進(jìn)入左主支氣管,待再次遇到阻力時停止插管,用37℃無菌生理鹽水3mL正壓緩慢注入肺內(nèi),可見大鼠左肺逐漸變得膨隆、蒼白,緩慢回收支氣管肺泡灌洗液,再將所得液體緩緩注入肺內(nèi),如此反復(fù)5次,最后一次注入后回收灌洗液,置于15mL的塑料離心管中(保存于冰浴中),此為第一次灌洗,然后重復(fù)4 次上述操作。將所得標(biāo)本計量后,于4℃ 1500 r/min,離心15min,上清液-70℃保存?zhèn)溆茫?xì)胞沉淀用溶紅細(xì)胞液懸浮,4℃ 1500r/min,離心10 min,棄上清,生理鹽水再次懸浮細(xì)胞沉淀,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),涂片Wright-Giemsa染色后,在油鏡下至少計數(shù)200個細(xì)胞。
1.2.3 肺部氣道觀察大鼠抽血致死后結(jié)扎主動脈、肺動脈,小心取出全部肺組織,用生理鹽水洗去表面浮血。沿肺門處剪下整葉肺組織,用4%多聚甲醛固定1d后常規(guī)制備病理切片,并進(jìn)行HE染色。制片后于病理圖像分析儀下觀察氣道變化程度并拍片對比。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計處理。統(tǒng)計學(xué)方法采用成組設(shè)計的t檢驗,以P<0.01時判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 細(xì)胞分類計數(shù)情況表1結(jié)果顯示,與正常組比較,病理模型組白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增加(P<0.01);與病理模型組比較,葛根素低濃度組、葛根素中濃度組、葛根素高濃度組及DEX組白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯降低(P<0.05);葛根素各濃度組與DEX組比較無明顯差異。
表1 大鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計數(shù)
2.2 肺部氣道觀察結(jié)果根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料[12],以氣道損傷程度、肺泡損傷程度及炎性細(xì)胞浸潤程度作為參考項進(jìn)行描述及比較。正常組肺組織切片(A),氣道形狀正常,氣道平滑肌無異常,無杯狀細(xì)胞形成附著,肺泡組織基本完整,周圍無或少量炎性細(xì)胞浸潤;病理模型組(B)與正常組相比,氣道損傷明顯,氣道平滑肌異常肥大,可見一定量杯狀細(xì)胞,肺泡組織損傷面大,炎性細(xì)胞浸潤程度高;葛根素低濃度組(C)與病理模型組相比,在葛根素作用下,氣道結(jié)構(gòu)及肺泡組織有修復(fù)跡象但不顯著,炎性細(xì)胞浸潤程度肉眼可見降低;葛根素中濃度組(D)氣道組織形態(tài)基本恢復(fù)正常(氣道邊緣修復(fù)、杯狀細(xì)胞數(shù)目減少等),肺泡組織有肉眼可見修復(fù)程度,炎性細(xì)胞浸潤程度顯著降低;葛根素高濃度組(E)氣道組織及肺泡組織已基本修復(fù)至正常狀態(tài),炎性細(xì)胞浸潤程度大幅度降低;DEX組(F)炎性細(xì)胞浸潤程度大幅度降低,氣道組織有少量修復(fù)跡象,肺泡組織修復(fù)不明顯。
圖1 不同組肺組織切片的視圖(HE染色,×200)正常組肺組織切片(A);病理模型組(B);葛根素低濃度組(C);葛根素中濃度組(D);葛根素高濃度組(E);DEX組(F)
支氣管哮喘是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥[13],是臨床十分典型的慢性呼吸道疾病。隨著病情的發(fā)展一些患者還會經(jīng)歷肺功能進(jìn)行性減弱,這是由于慢性炎癥會啟動氣道重建過程,其特點包括:粘液過度分泌、上皮剝落、平滑肌肥厚、纖維化等[14],因此支氣管哮喘經(jīng)常導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率。以往的哮喘治療方案多以控制氣道炎癥為主,但不能根治,且哮喘氣道炎癥反復(fù)發(fā)作,極可能與哮喘凝血平衡紊亂有關(guān),凝血平衡的紊亂對過敏性炎癥的永存狀態(tài)十分重要[11],必須要從控制炎癥與調(diào)節(jié)凝血平衡紊亂兩方面同時進(jìn)行治療。糖皮質(zhì)激素在炎癥控制方面有卓越的療效,但時效低且對組織修復(fù)無明顯促進(jìn)作用,且存在有相當(dāng)?shù)母弊饔?。而天然藥物葛根素在療效上滿足抗炎癥與改善凝血雙方面,且副作用要小于激素類藥物治療,理論上是治療哮喘的理想藥物。
在對哮喘大鼠模型進(jìn)行葛根素干預(yù)后,根據(jù)實驗結(jié)果,中、高劑量葛根素理論上有短期直接的療效,可使哮喘癥狀在短期內(nèi)迅速緩解;根據(jù)BALF細(xì)胞計數(shù)結(jié)果,葛根素低、中、高劑量組在總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)上都有著顯著減少,即表明低劑量也有一定的療效作用,若進(jìn)行長期用藥也有比較可觀的療效。在組織學(xué)方面,光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理切片,與正常組大鼠相比,病理模型組大鼠可見支氣管管壁增厚,管腔內(nèi)分泌物增多以及大量的嗜酸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤,同時可見氣道管腔杯狀細(xì)胞增生,黏膜不規(guī)則增生,皺褶減少,伴隨有不同程度的肺泡組織破損;經(jīng)葛根素干預(yù)后,哮喘大鼠肺組織支氣管管壁增厚程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度等也明顯減輕,并伴有肺泡組織的修復(fù),表明葛根素在氣道重建過程中也起到了往正常方向介導(dǎo)修復(fù)的作用。
本實驗所有結(jié)果均可在一定程度上證明葛根素在治療哮喘方面具有一定作用,為未來治療以哮喘為主的慢性呼吸道疾病藥物研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。
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Experimental study of Puerarin on the therapeutic effect of bronchial asthma
Zhang Lin-quan, Wu Peng, Cao Jiao-huan, Ma Jun, Liu Jie, Zhou Xian-xian, Zhang Jian-song
(Research Department of Applied Pathophysiology, Medical College, Hunan Normal University, Changsha, 410006, China)
ObjectiveObserving therapeutic effect of puerarin to bronchial asthma, and discussion preliminary treatment mechanism.MethodsEstablished ozone stress rat model of allergic asthma, according to different doses to rats drench, and observed rats physiological activity status; then conducted bronchoalveolar lavage fluid cell count and observed lung airway tissue sections, counted number of total cells, eosinophils and neutrophils.ResultsPuerarin could significantly weaken asthma symptoms in rats, reduced lung inflammatory cell infiltration, also can mediate normally airway repair, repair degree and doses level to a positive correlation.ConclusionPuerarin on bronchial asthma have a better therapeutic effect, the mechanism may be associated with airway inflammation and regulate anti-coagulation balance disorders.
puerarin; bronchial asthma; rat; chronic inflammation
R562.25
A
1673-016X(2016)06-0001-03
2016-08-10
湖南省科技廳計劃項目(2015SK2066);2014年國家級大學(xué)生創(chuàng)新課題(NO.201410542015)
張堅松,E-mail:jwc_zjs@126.com