朱全杰，段曉明，何 蜜，劉海濤

（1.湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006；2.長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院消化內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410006；3.湘潭市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湘潭 411100；4.湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

HA轉(zhuǎn)hGM-CSF HepG2疫苗對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT的影響及機(jī)制

朱全杰1，段曉明2，何 蜜3，劉海濤4

（1.湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006；2.長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院消化內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410006；3.湘潭市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湘潭 411100；4.湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

目的：探討HA轉(zhuǎn)hGM-CSF HepG2疫苗逆轉(zhuǎn)IL-6誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機(jī)制。方法：體外用HA轉(zhuǎn)hGM-CSF HepG2疫苗共培養(yǎng)受IL-6刺激的HepG2細(xì)胞，采用Traswell遷移實(shí)驗(yàn)，Westernblot、RT-PCR方法分別檢測(cè)疫苗處理前后HepG2細(xì)胞的增殖及侵襲能力的變化、EMT標(biāo)志物E-cadherin、調(diào)控因子（p-Stat3、Twist）蛋白及E-cadherin mRNA、Twist mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果：①I(mǎi)L-6組較陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②IL-6組較陰性對(duì)照組E-cadherin的表達(dá)水平降低，p-Stat3、Twist蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③疫苗組的穿膜細(xì)胞數(shù)較其他三組明顯減少，侵襲能力下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④轉(zhuǎn)染后的疫苗組較其他三組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而p-Stat3、Twist蛋白表達(dá)下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤疫苗組較其他三組E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)、Twist mRNA表達(dá)下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：①I(mǎi)L-6能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象。②60Co處理的轉(zhuǎn)hGM-CSF基因HepG2疫苗可能通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Twist 及Stat3的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT。

肝癌；hGM-CSF 基因；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；腫瘤疫苗；IL-6

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居我國(guó)腫瘤死亡率第三位［1］，盡管當(dāng)前肝臟外科的診療技術(shù)不斷提高，但有機(jī)會(huì)手術(shù)治療的患者仍不到30%；即使手術(shù)，3年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)75%，究其原因主要是肝癌起病隱匿，轉(zhuǎn)移率高，多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期，且目前認(rèn)為肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因，多途徑和多階段的復(fù)雜過(guò)程，發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，這個(gè)肝癌綜合治療帶來(lái)了一定難度［2，3］。研究顯示在腫瘤細(xì)胞中JAK/STAT3 信號(hào)通路持續(xù)激活可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）通過(guò)激活STAT3，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的侵襲作用［4-6］。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后twist基因表達(dá)上調(diào)，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，p-stat3上調(diào)，使細(xì)胞黏附能力下降，侵襲和遷移能力增強(qiáng)［7］。在我們前期的研究中已證實(shí)HA納米載體轉(zhuǎn)hGM－CSF基因的HepG2 疫苗具有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，降低免疫耐受，抗腫瘤的作用［8］。但具體機(jī)制仍不十分清楚，本研究主要通過(guò)將hGM－CSF基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并制備成腫瘤疫苗，然后觀察其對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT的影響及其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑HepG2細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫(kù)饋贈(zèng)。人IL-6購(gòu)于Peprotech公司；羥基磷灰石購(gòu)買(mǎi)于上海源葉生物公司；（Human）GM-CSF質(zhì)粒購(gòu)自于上海吉?jiǎng)P基因；一抗試劑：?jiǎn)慰寺ˇ?actin抗體購(gòu)自于美國(guó)proteintech公司、單克隆抗體（E-cadherin、twist、p-stat3）均購(gòu)自于美國(guó)abcam公司；二抗試劑均購(gòu)自于美國(guó)proteintech公司；ranswell板（8 μm）購(gòu)自Corning公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于 Pierce公司；RNaseA購(gòu)于中國(guó)上海碧云天生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRTPCR試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京康為世紀(jì)公司。

1.2 IL-6誘導(dǎo)HepG2 EMT參照文獻(xiàn)［9］方法；將人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞密度為1×107/mL，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，胰酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。IL-6組用含50 ng/mL IL-6孵育HepG2細(xì)胞24 h（IL-6組），陰性對(duì)照組則采用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（陰性對(duì)照組），于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 基因轉(zhuǎn)染及疫苗制備參照文獻(xiàn)［10］方法；將課題組構(gòu)建的GV230-hGM-CSF 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞株（重組質(zhì)粒組），用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，PBS重懸細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞密度為1×107/mL；取體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)入hGM-CSF基因的HepG2細(xì)胞，經(jīng)亞致死劑量（10 Gy）的放射線(xiàn)間斷照射后制備成轉(zhuǎn)hGM-CSF基因的HepG2疫苗（疫苗組）；采用Western-blot和RT-PCR方法驗(yàn)證兩種細(xì)胞hGMCSF基因的表達(dá)；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)；以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒（空質(zhì)粒組）及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞（空白對(duì)照組）作為對(duì)照。

1.4 Transwell 試驗(yàn)HepG2細(xì)胞的體外侵襲能力：在侵襲小室的上、下室之間鋪有用基質(zhì)膠（matrigel）制備好的侵襲膜，取各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞懸液用（0 ng/mL、50 ng/ mL，IL-6作用24 h），按100 μL每孔，接種于侵襲膜上，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，擦去膜上細(xì)胞及基質(zhì)膠，取膜、固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot 法檢測(cè)Twist、E-cadherin 和Stat3蛋白的表達(dá)提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。按照每孔50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，一抗（β-actin 1：4000、E-cadherin 1：10000、twist 1：500、p-stat3 1：200000）4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，二抗（1：3000），室溫孵育1h，TBST 漂洗3次，每次15min，ECL化學(xué)發(fā)光，采集圖像，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qRT-PCR 法檢測(cè)E-cadherin 和Twist mRNA的表達(dá)用PBS 洗滌各組細(xì)胞3次，向各孔加入1 mL RNAiso Plus，按說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA，吸取2 μL RNA溶液于石英比色皿中，用無(wú)酶水定容至100 μ L，紫外分光光度儀測(cè)A260 /A280的比值，重復(fù)3次，計(jì)算RNA 濃度（RNA濃度（ng/μL）=A260×稀釋倍數(shù)×40），以mRNA為模板將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，使用2－△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)（表1），引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以“mean±SD”表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較滿(mǎn)足方差齊性要求時(shí)用LSD，如不滿(mǎn)足方差齊性要求時(shí)采用Tambane，s T2，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞侵襲能力的變化Transwell 顯示，IL-6組較陰性對(duì)照組侵襲能力明顯增強(qiáng)，IL-6組穿膜細(xì)胞數(shù)為（174.4± 6.3）個(gè)，而陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（112.5±3.1）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后疫苗組較其他三組侵襲能力下降，疫苗組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（61.4±3.6）個(gè)，分別與重組質(zhì)粒組（83.6±6.0）個(gè)、空質(zhì)粒組（169.4±5.2）個(gè)、空白對(duì)照組（171.4±5.6）個(gè)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖1 IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞后侵襲能力的變化（100×）：A IL-6組B.陰性對(duì)照組

圖2 轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因?qū)L-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞侵襲能力影響的變化（100×）：C.空白對(duì)照組D.重組質(zhì)粒組E.空質(zhì)粒組F.疫苗組

2.2 IL-6誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化

2.2.1 IL-6誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化（表2）

表2 各組細(xì)胞p-STAT3、Twist 及E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2.2 轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物及相關(guān)調(diào)控因子的變化（表3）

表3 各組細(xì)胞p-STAT3、Twist 及E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 Western-blot法檢測(cè)IL-6誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化：1.陰性對(duì)照組 2.IL-6組 3.空白對(duì)照組 4.空質(zhì)粒組 5.疫苗組 6.重組質(zhì)粒組

2.3 轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞Twist、E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

表4 各組細(xì)胞Twist、E-cadherin mRNA 表達(dá)比較

圖4 qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染hGM-CSF基因后HepG2細(xì)胞后E-cadherin、Twist mRNA相對(duì)表達(dá)

3 討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)EMT可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如膀胱癌、原發(fā)性肝癌、結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等［11-13］。EMT最主要的分子標(biāo)志是上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)，且E-Cadherin蛋白的表達(dá)缺少是上皮性腫瘤細(xì)胞侵襲的前提條件［9］。相關(guān)報(bào)道，IL-6可持續(xù)激活JAK/STAT3 信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［14-15］。我們的研究顯示用IL-6處理HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞間隙增寬，呈紡錘狀或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核顏色變深，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，這與吳暢等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Traswell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)；在蛋白及基因表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)，用IL-6處理HepG2細(xì)胞后，STAT3磷酸化水平升高，并使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白及基因表達(dá)上調(diào)，EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin蛋白及基因表達(dá)下調(diào)，這與宋瑩等［16］肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用機(jī)制研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明IL-6確實(shí)具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT的作用，且使HepG2細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的研究顯示將60Co處理的轉(zhuǎn)hGMCSF基因HepG2疫苗與經(jīng)50 ng/ml IL-6處理的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，Traswell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示疫苗組較CON組、重組質(zhì)粒組及空白對(duì)照組相比，其穿膜細(xì)胞數(shù)減少，提示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力下降；Western-blot實(shí)驗(yàn)顯示疫苗組較CON組、重組質(zhì)粒組及空白對(duì)照組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而p-Stat3、Twist蛋白表達(dá)下降，且RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示疫苗組較另外三組E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)、Twist mRNA表達(dá)下調(diào)，這與隋強(qiáng)君等［17］在阻斷肝癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答作用機(jī)制研究結(jié)果相似。還有研究顯示活化的STAT3 信號(hào)參與Twist、E-cadherin蛋白表達(dá)，調(diào)控EMT過(guò)程，并介導(dǎo)肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，p-STAT3/Twist/ E-cadherin 信號(hào)軸異?？赡軐?dǎo)致肝癌病人預(yù)后差［18-20］。相關(guān)研究證實(shí)Th1/Th2細(xì)胞的偏移在EMT中發(fā)揮重要作用［21，22］。本課題組前期已證實(shí)該疫苗能通過(guò)增加HepG2 細(xì)胞免疫原性，誘導(dǎo)Th1 漂移，促進(jìn)PBMC增殖、分化，干擾Th2類(lèi)細(xì)胞因子如lL-6等對(duì)CD4+T 細(xì)胞調(diào)節(jié)，增加INF-γ的分泌，提高其對(duì)HepG2 細(xì)胞的殺傷作用［8］。而我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)hGM-CSF基因HepG2疫苗與IL-6共培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞后p-Stat3、Twist蛋白表達(dá)下降，Twist mRNA表達(dá)下調(diào)，提示IL-6/ p-STAT3/Twist信號(hào)軸被抑制。因此我們認(rèn)為HA轉(zhuǎn)hGM-CSF的HepG2細(xì)胞疫苗可能通過(guò)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Th1漂移，阻斷JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)Twist的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT，抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，IL-6能促進(jìn)HepG2細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，而轉(zhuǎn)hGM-CSF的HepG2細(xì)胞疫苗可通過(guò)阻斷JAK/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2細(xì)胞EMT，為肝癌的免疫治療提供新思路，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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The effect of HepG2 tumor vaccine transfected hGM-CSF gene mediated by HA nanoparticles on inducing HepG2 cells epithelial-mesenchymal transition through IL-6

Zhu Quan-jie1, Duan Xiao-ming2, He Mi3, Liu Hai-tao4

(1. The Affiliated Changsha Hospital of Hunan Normal University, Changsha 410006, China; 2. Department of Gastroenterology, Fouth Hospital of Changsha, Changsha 410006, China; 3. Department of oncology, Xiangtan Central Hospital, Xiangtan 411100, China; 4. The Affiliated Changsha Hospital of Hunan Normal University, 410006, China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of HepG2 tumor vaccine transfected hGM-CSF gene mediated by HA nanoparticles on inducing HepG2 cells epithelial-mesenchymal transition through interleukin-6(IL-6).MethodsHepG2 cells transfected with GM-CSF Gene after60Co irradiation vaccine were co-cultured with IL-6 stimulated HepG2 cells in vitro. The vaccine group and other group cells migration and invasion were detected by transwell chamber assays； the expression of E-cadherin, p-Stat3, Twist proteins was evaluated by Western blot； the expressions of EMT-associated genes: E-cadherin, Twist in HepG2 cells were analyzed with real-time fluorescence quantitative (q RT-PCR).Results①By pretreatment with IL-6, the ability of cell migration and invasion was significantly increased； IL-6 group cells passing through the reconstituted basement membrane higher than negative control group. ②The expression level of E-cadherin in IL-6 group was lower than that in negative control group, the expression of Twist and p-Stat3 protein was increased. ③Vaccine group cells passing through the reconstituted basement membrane less than other three groups. ④vaccine group than the other three groups of E-cadherin protein expression increased, whereas the expression of p-STAT3 and twist proteins decreased . ⑤In Vaccine group the expression of E-cadherin mRNA up-regulated compared with other groups, while Twist mRNA down-regulated.Conclusion①I(mǎi)L-6 has the ability to induce HepG2 cells to produce EMT. ②HepG2 cells transfected with GM-CSF Gene after60Co irradiation vaccine may reverse IL-6 induced HepG2 cell EMT by down-regulated the expression of transcription factor Twist and Stat3.

hepatoma carcinoma； GM-CSF gene； epithelial-mesenchymal transition； tumor vaccine； IL-6

R73-36+2；R735.7

A

1673-016X（2016）06-0004-04

2016-08-28

湖南省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（NO.2005-178）

段曉明，E-mail：xiaomingduan@21cn.com