段先哲　李　南*　譚凱旋　謝焱石　胡　楊　陳　亮　韓世禮　馮志剛　馬　強(qiáng)　劉　珊

(1. 南華大學(xué)，衡陽(yáng)421001；2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽(yáng)4210001)

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儀器應(yīng)用

高效液相色譜法測(cè)定蘋果酸中的其它有機(jī)酸

段先哲1,2李南1,2*譚凱旋1謝焱石1胡楊1陳亮1韓世禮1馮志剛1馬強(qiáng)1劉珊1

(1. 南華大學(xué)，衡陽(yáng)421001；2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽(yáng)4210001)

摘要：建立了測(cè)定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的高效液相色譜檢測(cè)方法。色譜柱為磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流動(dòng)相為0.002mol/L H2SO4，流速為0.5mL/min，進(jìn)樣量為50μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為55℃。系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中蘋果酸的理論塔板數(shù)大于5000，馬來酸與富馬酸分別與相鄰的峰分離度大于1.9，說明此方法檢測(cè)蘋果酸中的馬來酸和富馬酸靈敏度高，分離度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中6份供試溶液中富馬酸和馬來酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，方法精密度良好。3種水平濃度下的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，方法準(zhǔn)確度良好。該方法可作為蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的定量分析方法。

關(guān)鍵詞：蘋果酸馬來酸富馬酸高效液相色譜

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，它是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)等。在食品行業(yè)中，L-蘋果酸是國(guó)際上公認(rèn)的一種安全性食品添加劑,也是一種優(yōu)良的調(diào)酸劑和保鮮劑[1]。在醫(yī)藥行業(yè)，蘋果酸作為一種藥物成分，常用于藥物制劑、片劑、糖漿和氨基酸溶液中，能明顯提高氨基酸的吸收率以及治療肝病、貧血、免疫力低下等多種疾病，所以需要嚴(yán)格控制蘋果酸生產(chǎn)過程中所帶來的雜質(zhì)(如馬來酸和富馬酸等)。因此，對(duì)蘋果酸及其中的馬來酸與富馬酸的測(cè)定方法的研究具有重大意義。目前國(guó)內(nèi)有對(duì)蘋果酸含量測(cè)定的方法有酶法[2]、生物傳感器法[3]、雙波長(zhǎng)分光光度法[4]、離子色譜法[5-7]、氣相色譜法[8，9]、毛細(xì)管電泳法[10-11]和高效液相色譜法[12-16]等。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的高效液相色譜檢測(cè)方法，采用磺酸基陽(yáng)離子交換色譜柱，具有更高的分離度和檢測(cè)靈敏度。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

蘋果酸(中照力德化工有限公司)；富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究所)；馬來酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；硫酸，分析純；

島津HPLC-20A；CPA225D型電子天平(賽多利斯)。

1.2色譜條件

色譜柱為磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流動(dòng)相為0.002mol/L H2SO4，流速為0.5mL/min ，進(jìn)樣量為50μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為55℃。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

精密稱取馬來酸和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品，加流動(dòng)相分別配置2μg/mL馬來酸和5μg/mL富馬酸，分別作為馬來酸和富馬酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL加流動(dòng)相稀釋到10mL，即得馬來酸和富馬酸混合對(duì)照溶液，其中雜質(zhì)含量均用外標(biāo)法計(jì)算。

2結(jié)果與討論

2.1色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用磺酸基色譜柱。常用的硅膠柱分析有機(jī)酸時(shí)流動(dòng)相為水溶液，無有機(jī)相，且其pH值低于或接近色譜柱耐受極限，長(zhǎng)時(shí)間用此極限的流動(dòng)相條件會(huì)極大降低色譜柱柱效及其使用壽命[13]，而磺酸基色譜柱更適用于較低的pH值和無有機(jī)相的水溶液流動(dòng)相，具有更高的分離度和檢測(cè)靈敏度。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)蘋果酸、馬來酸和富馬酸溶液進(jìn)行掃描，得出蘋果酸在210nm處有最強(qiáng)的紫外吸收，馬來酸和富馬酸在210 nm處檢測(cè)有很高的靈敏度，所以檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為210nm。

2.3系統(tǒng)適用性

稱取L-蘋果酸用品約30mg，量取混合對(duì)照溶液3mL置100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，即為系統(tǒng)適用性溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，蘋果酸的理論塔板數(shù)大于5000，蘋果酸、馬來酸與富馬酸分別與相鄰的峰分離度大于1.9，說明此方法檢測(cè)蘋果酸中的馬來酸和富馬酸具有較高的靈敏度和良好的分離度。

表1　方法的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配置0.1mg/mL蘋果酸樣品溶液6份，分別在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，6份供試液中富馬酸和馬來酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，方法精密度良好。

表2　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在蘋果酸樣品中分別加入3種不同濃度的馬來酸和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度水平的溶液平行配置3份，分別在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3種水平濃度下的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，方法準(zhǔn)確度良好。

表3　方法的回收率

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單有效的測(cè)定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)說明此方法檢測(cè)蘋果酸中的馬來酸和富馬酸靈敏度較高，分離度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，馬來酸和富馬酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，方法精密度良好。3種水平濃度下的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%。因此，該方法簡(jiǎn)便、快速、有效、靈敏、準(zhǔn)確、具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可作為蘋果酸中馬來酸和富馬酸的定量分析方法。

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Determination of other organic acids in malic acid by high performance liquid chromatography.DuanXianzhe1,2，LiNan1,2*，TanKaixuan1，XieYanshi1，HuYang1，ChenLiang1，HanShili1,FengZhigang1，MaQiang1，LiuShan1

(1.UniversityofSouthChina，Hengyang421001，China; 2.HunanProvinceCooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment，Hengyang421001，China)

Abstract:Chromatographic column was Carbomix H-NP (7.8×300mm，10μm); the mobie phase was 0.002mol/L H2SO4; the flow rate was 0.5mL/min.; the injection volume was 50μL; the detection wavelength was 210nm，and the column temperature was 55℃. In the system suitability experiment，the theoretical plate number of malic acid was more than 5000，the resolution of maleic and fumaric acids were greater than 1.9，indicating that this method had a high sensitivity and good resolution for detection of maleic and fumaric acids in malic acid. In the repeated experiment，the relative standard deviation of the concentrations of fumaric and maleic acids in 6 repeated samples was less than 3%，showing a satisfactory precision of this method. In the spiked experiment of three levels，the average recovery of maleic and fumaric acids was between 90% and 120%，all the relative standard deviations were less than 4%，demonstrating that this method was considerably accurate. This method can be used for quantitative determination of maleic and fumaric acids in the malic acid.

Key words:malic acid; maleic acid; fumaric acid; high performance liquid of chromatography (HPLC)

收稿日期：2015-09-14

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.01.004

作者簡(jiǎn)介：段先哲，男，1985出生，博士，主要從事地球化學(xué)、儀器分析及相關(guān)研究工作。*通訊作者：李南，女，1985出生，碩士，主要從事分析化學(xué)、儀器分析及相關(guān)研究工作，Email：linan19851018@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(41503016)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(15B201)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M582334)；國(guó)防基礎(chǔ)科研計(jì)劃項(xiàng)目(B3720110004)；南華大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2014XQD08)；南華大學(xué)“蒸湘學(xué)者計(jì)劃”。