吉圣珺，葉志堅，陳耀豐，劉劍，張培芳，鄭韶欣

(1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 佛山 528000；2.廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

·論 著·

TNF-α誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡Caspase-3活性的研究

吉圣珺1，葉志堅1，陳耀豐1，劉劍1，張培芳1，鄭韶欣2

(1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 佛山 528000；2.廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

目的 探討凋亡“核心蛋白酶”-半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞(HPMVECs)凋亡中的作用。方法體外培養(yǎng)HPMVECs，空白對照組置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，TNF-α組分別以10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL濃度刺激HPMVECs，使用MTT比色法檢測各組細胞活性，AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，流式細胞術(shù)檢測Caspase-3的活性。結(jié)果空白對照組的細胞凋亡率及Caspase-3活性最低；空白對照組和TNF-α組(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)比較，100 ng/mL TNF-α組的相對細胞活性最低，而細胞凋亡率及Caspase-3活性最高，TNF-α誘導HPMVEC凋亡時呈現(xiàn)出濃度依賴性，隨著時間的延長，Caspase-3活性逐漸升高(P＜0.05)。結(jié)論TNF-α誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡呈現(xiàn)濃度依賴性，Caspase-3可能參與了這一細胞凋亡過程的調(diào)控。

腫瘤壞死因子-α；人肺微血管內(nèi)皮細胞；凋亡；半胱氨酸蛋白酶-3

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是其常見的并發(fā)癥之一，PH的發(fā)生與COPD患者死亡率的顯著增加相關(guān)[1]。缺氧及炎癥引起肺血管收縮及重構(gòu)是慢性阻塞性肺疾病發(fā)生肺動脈高壓的重要病理生理基礎(chǔ)，肺血管內(nèi)皮損傷是PH發(fā)病的起始環(huán)節(jié)，而血管內(nèi)皮細胞凋亡是血管內(nèi)皮損傷的重要機制[2-3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族是一組特異性切割天冬氨酸殘基上的肽鍵繼而引起細胞凋亡的蛋白水解酶，是所有凋亡蛋白中最主要的執(zhí)行者[4]。Caspase-3在血管內(nèi)皮細胞的凋亡信號傳導路徑中占據(jù)著的核心地位，是凋亡信號傳導的共同通路[5]。目前尚未見到有關(guān)于TNF-α誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞(HPMVEC)凋亡與Caspase-3活性變化的相關(guān)報道。本研究探討了TNF-α誘導HPMVEC的凋亡及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HPMVEC株購自上海細胞庫，100 mL/L胎牛血清及高糖細胞培養(yǎng)基購自Hy-clone公司，四甲基偶氮唑藍購自Sigma公司，Caspase-3活性檢測試劑盒、流式細胞儀購自BD公司，異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.2 HPMVEC的復蘇和傳代培養(yǎng) 從液氮保存罐中取出凍存管(含原代HPMVEC)，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。將其置于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。內(nèi)皮細胞呈鵝卵石樣貼壁生長，當細胞生長至90%匯合時用2.5 g/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)胰蛋白酶進行消化傳代，取第4代血管內(nèi)皮細胞進行實驗。

1.3 實驗分組及處理 空白對照組：用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細胞，置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；TNF-α組：分別用10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL TNF-α進行刺激，然后用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細胞，置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測HPMVEC的增殖活性 MTT比色法測定各組細胞的活性。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞數(shù)；以4 000個/孔細胞接種到96孔板中。37℃、50 mL/L CO2條件下孵育1 d；棄去培養(yǎng)液，按上述實驗分組方法處理細胞。吸干培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低度振蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長各孔的吸光度(A)值。細胞活力=(A處理組-A空白管)/(A空白對照組-A空白管)× 100%。

1.5 AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測HPMVEC的凋亡 細胞分為空白對照組、TNF-α處理組。每組取3個6孔板的培養(yǎng)孔，胰蛋白酶消化(不含EDTA)收集細胞，1 000×g離心5 min，棄上清。磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞后，離心，重復兩次后棄上清。分別加入結(jié)合緩沖液200 μL重懸并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)。取200 μL細胞懸液，加入5 μL annexinⅤ-FITC混勻，室溫避光10 min。再加入5 μL PI染液混勻，流式細胞儀進行檢測分析：每份樣品取1×104個細胞PI染色，做DNA分析。

1.6 Caspase-3的活性檢測 根據(jù)預實驗結(jié)果，實驗分為空白對照組、TNF-α處理組。分別收集各組細胞。1 500 r/min離心10 min，用預冷的PBS洗滌細胞兩次；4℃、300×g離心5 min，收集(1～5)×105個細胞；加氟甲基酮標記的轉(zhuǎn)錄因子2-天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸(Transcription factor 2-Asp-Glu-Val-A sp-fluoromethylketone，TF2-DEVD-FMK)，37℃反應1 h；流式細胞術(shù)分析Caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度[6-7]。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT比色法檢測細胞活性 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mLTNF-α處理組與100 ng/mLTNF-α處理組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的相對細胞活性明顯低于空白對照組(P＜0.01)，TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表1。

組別空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL OD值1.97±0.05相對細胞活性(%) 100±0.00 1.84±0.01 1.81±0.02a1.71±0.02a1.53±0.02abcd93.68±3.30 92.24±2.55a87.30±2.64a77.93±2.97abcd

2.2 AnnexinⅤ/PI檢測HPMVEC凋亡 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的細胞凋亡率最高(P＜0.01)，TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表2。

表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(n=3，±s)

表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(n=3，±s)

組別空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL細胞凋亡率(%) 0.00±0.005 5.57±0.23a6.69±0.17ab8.67±0.25abc10.76±0.25abcd

2.3 HPMVEC的Caspase-3活性檢測 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為43.85、96.24、26.45，P值分別為0.000 5、0.000 1、0.001，P＜0.05)，而100 ng/mL TNF-α處理組的Caspase-3活性最高(t=16.77，P= 0.004)，隨著時間的延長，Caspase-3活性逐漸升高，與空白對照組比較，100 ng/mL TNF-α組在24 h時Caspase-3的活性最高(t=62.06，P=0.003)，見表3。

表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(n=3，±s)

表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(n=3，±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與10 ng/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 ng/mL TNF-α組比較，cP＜0.05；與50 ng/mL TNF-α組比較，dP＜0.05；與0 h組比較，eP＜0.05；與6 h組比較，fP＜0.05；與12 h組比較，gP＜0.05。

組別Caspase-3活性(%) 0 h 6 h 12 h 24 h空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL 0.39±0.184.98±0.585.79±0.386.03±0.38 15.36±0.92aefg17.37±0.92aefg24.56±0.77abcefg25.39±0.59abcdef5.2±0.33a5.98±0.16a8.12±0.47abc11.33±1.00abcd9.2±0.56ae10.52±0.82ae13.39±1.00abce16.65±0.72abcde10.97±0.97ae14.05±0.55abef16.85±0.85abcef23.60±0.80abcdef

3 討 論

COPD是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，目前已成為全球第四大致死性病因[8]。PH是其重要的合并癥，炎癥反應是COPD患者形成PH的重要因素[9]，炎癥引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡是PH發(fā)生的重要機制[10]。近年來，有關(guān)于血管內(nèi)皮細胞凋亡與PH之間的研究逐漸增多[11-13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL的TNF-α即可引起HPMVEC發(fā)生凋亡，隨著TNF-α濃度的增加，HPMVEC凋亡率亦增加；100 ng/mL的TNF-α作用于HPMVEC時，細胞凋亡率最高，TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。Chen等[14]研究也支持本實驗的結(jié)果。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡的增加與Caspase-3的表達增強相關(guān)。

筆者進一步探討了TNF-α誘導HPMVEC凋亡的分子機制。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞凋亡主要有兩條信號轉(zhuǎn)導通路，分別由Caspase-8激活的外源性途徑即死亡受體途徑及Caspase-9激活的細胞內(nèi)在途徑即線粒體通路，而兩者最終均需要通過激活Caspase-3來實現(xiàn)，因此，目前認為，Caspase-3是血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡的標志物。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α作用濃度的增加及時間的延長，Caspase-3的活性表達亦隨之增強，Caspase-3的活性表達與HPMVEC凋亡率的增加呈正相關(guān)關(guān)系。與Ohtsubo等[16]研究結(jié)果相符合。有關(guān)于血管內(nèi)皮細胞凋亡信號通路的探討是近年來PH的研究熱點，除了 Caspase-3通路，還包括 PI3K/AKT[17]、P38MAPK[18]及STAT3[19-20]等通路途徑。在未來的研究中，我們將進一步探討Caspase-3的上游信號通路，進一步了解TNF-α誘導HPMVEC凋亡的完整信號分子傳導途徑。

綜上所述，筆者認為TNF-α可誘導HPMVEC發(fā)生凋亡，并且這一凋亡作用呈現(xiàn)濃度依賴性。而在細胞凋亡過程中，Caspase-3的活性表達增強，因此，TNF-α誘導HPMVEC凋亡可能與上調(diào)Caspase-3的活性表達有關(guān)。

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Caspase-3 activity in TNF-α-induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells.

JI Sheng-jun1,YE Zhi-jian1,CHEN Yao-feng1,LIU Jian1,ZHANG Pei-fang1,ZHENG Shao-xin2.1.Department of Respiratory Medicine,the First People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;2.Department of Cardiology,Sun Yat-sen Memorial Hospital of the Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the change of Caspase-3 activity in tumor necrosis factor-α(TNF-α)induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs).MethodsHPMVECs were cultured in vitro.The blank control was treated in a carbon dioxide incubator.HPMVECs were treated by TNF-α at the concentration of 10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL,or 100 ng/mL.The activity of cells,apoptosis rate,as well as the expressions of Caspase-3 in HPMVECs were determined respectively by MTT cell viability assay,flow cytometric analysis with dual Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)staining and flow cytometry.ResultsApoptosis rate of cell and Caspase-3 activity were the lowest in the blank control group.Compared with the other groups(10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL),the Caspase-3 activity and apoptosis rate of cell in 100 ng/mL TNF-α group were highest,and with the lowest cell activity. The inhibition of TNF-α-induced cell activity was a manner of dose-dependent.The Caspase-3 activity increased gradually with time(P＜0.05).ConclusionTNF-α-induced apoptosis of HPMVEC is a manner of dose-dependent,and Caspase-3 may be taking part in the control of apoptosis process.

Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs);Apoptosis;Caspase-3

R329.2+7

A

1003—6350（2016）14—2237—04

2016-02-23)

國家自然科學基金(編號：81400251)；廣東省佛山市衛(wèi)生及計生局醫(yī)學科研立項課題(編號：2015255)

鄭韶欣。E-mail：schwannnn@163.com