韓蕓，王強(qiáng)

(什邡市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科1、檢驗(yàn)科2，四川 什邡 618400)

Id-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

韓蕓1，王強(qiáng)2

(什邡市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科1、檢驗(yàn)科2，四川 什邡 618400)

目的 探討分化抑制因子2(Id-2)在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。方法選擇2013年1月至2015年6月在我院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者56例為研究對(duì)象。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)所有患者腸癌組織和其中26例患者癌旁正常腸上皮組織中Id-2的表達(dá)水平，比較陽(yáng)性與陰性表達(dá)者間的年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的差異。結(jié)果免疫組織化學(xué)染色顯示，Id-2主要表達(dá)于胞漿，其在腸癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.3%(36/56)和34.6%(9/26)，癌組織陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；臨床病理特征分析顯示，在結(jié)直腸癌中，Id-2陽(yáng)性表達(dá)與患者TNM分期(P＜0.05)、病理分級(jí)(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關(guān)，陽(yáng)性患者Ⅲ～Ⅳ、低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例明顯高于陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Id-2陽(yáng)性患者的中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間為24.7個(gè)月，陰性患者為38.5個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.23，95%CI：1.02～4.87，P＜0.05)。結(jié)論Id-2蛋白可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且陽(yáng)性患者預(yù)后較差。

結(jié)直腸癌；分化抑制因子2；免疫組織化學(xué)；臨床病理參數(shù)；生存時(shí)間

分化抑制因子2(Inhibitor of differentiation 2，Id-2)屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)蛋白家族的Id家族成員，分子生物學(xué)功能研究顯示，其能夠負(fù)性調(diào)控bHLH轉(zhuǎn)錄因子的活性[1]。因而在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有總要功能。近年來(lái)研究顯示Id-2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)并與患者的預(yù)后不良有關(guān)[2-3]。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中Id-2表達(dá)水平探討其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床結(jié)直腸癌的診治及預(yù)后工作提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年6月我院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者56例為研究對(duì)象。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)所有患者腸癌組織和其中26例患者癌旁正常腸上皮組織中Id-2的表達(dá)水平。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；臨床病例資料完整；有隨訪數(shù)據(jù)；組織病理標(biāo)本獲取經(jīng)家屬書面同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過(guò)新輔助放化療或生物治療者；病理學(xué)診斷不明確者；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；臨床病理資料不全者。56例結(jié)直腸癌患者中男性31例，女性25例，平均年齡(57.2±16.6)歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期31例。

1.2 儀器與試劑 石蠟切片機(jī)(購(gòu)自德國(guó)徠卡公司)；顯微鏡(購(gòu)自日本奧林巴斯公司)、電熱恒溫箱(上海榮珂檢測(cè)儀器有限公司生產(chǎn))、微波爐，臺(tái)式離心機(jī)(購(gòu)自BechmanCoulter公司)。

1.3 主要試劑 鼠抗人Id-2多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；即用型免疫組織化學(xué)法試劑盒購(gòu)自上海美軒生物科技公司；DAB顯示試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性對(duì)照片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 Id-2免疫組化檢測(cè) 脫蠟和水化：腫瘤組織石蠟包埋后進(jìn)行組織切片(4～7 μm)，然后二甲苯洗滌切片3次，每次5 min進(jìn)行脫蠟；接著分別用100%和95%的乙醇洗滌切片各3次，每次5 min，進(jìn)行水化。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將切片置于3%H2O2: (30%H2O2:甲醇=l:9)中，避光孵育15 min；dH2O潤(rùn)洗5 min?？乖迯?fù)：將切片置于抗原修復(fù)液(濃縮液:水=15 mL:1 600 mL)中，微波修復(fù)25 min，在微波過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)加滿抗原修復(fù)液，5 min加一次。洗滌：室溫冷卻20 min，以蒸餾水沖洗后，用TBST洗滌兩次，每次5 min。封閉：用100 μL含10%的正常驢血清(TBST稀釋)將滴在組織處，并用剪切好的衛(wèi)生紙覆蓋，濕盒里孵育1 h。加一抗：加入實(shí)驗(yàn)所需一抗，用10%血清稀釋到合適的終濃度，滴在組織處，并用衛(wèi)生紙覆蓋放入濕盒中，4℃孵育過(guò)夜，同時(shí)以同型抗體作為陰性對(duì)照。洗滌：用TBST洗滌3次，每次15 min。加二抗：加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1:100)，室溫孵育1 h。顯色：根據(jù)實(shí)驗(yàn)中所用的顯色試劑盒，根據(jù)要求操作。一般可用親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色。蘇木精復(fù)染：用蘇木精染核2～4 min。反藍(lán)：用1%鹽酸處理1 min。洗滌封片：dH2O洗滌2次，5～10 min，封片，干燥后顯微鏡先觀察拍照。

1.5 陽(yáng)性結(jié)果判定[4]采用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判定，在顯微鏡下每張載玻片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)及Id-2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞均以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為主。陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為(-)；陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%為(+)；陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%為(++)；陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率檢驗(yàn)；生存分析采用風(fēng)險(xiǎn)比例模型Log-rank檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Id-2蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示，Id-2主要表達(dá)于胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)其在腸癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.3%(36/56)和34.6%(9/26)，癌組織顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。

圖1 Id-2蛋白在癌組織中的表達(dá)(×40)

2.2 Id-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系 臨床病理特征分析顯示，在上結(jié)直腸癌中Id-2陽(yáng)性表達(dá)與患者TNM分期(P＜0.05)、病理分級(jí)(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)(P＜0.05)移有關(guān)，陽(yáng)性患者Ⅲ～Ⅳ、低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例明顯高于陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 Id-2表達(dá)與患者預(yù)后 Id-2陽(yáng)性患者的中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間為24.7個(gè)月，陰性患者為38.5個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.23，95%CI：1.02～4.87，P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 Id-2表達(dá)與患者無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間

表1 Id-2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(例)

3 討 論

結(jié)直腸癌是臨床上較為常見(jiàn)的一類消化系統(tǒng)腫瘤，新近的腫瘤流行病學(xué)研究顯示，北美2012年新發(fā)結(jié)直腸癌患者約為14萬(wàn)，死亡患者5萬(wàn)，結(jié)直腸癌已成為美國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[5]。在我國(guó)尚缺乏相對(duì)完整的全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)體腫瘤或結(jié)直腸癌流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但區(qū)域性發(fā)病率研究顯示，近年來(lái)隨著人口老齡化的加劇、飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出了上升趨勢(shì)和年輕化趨勢(shì)[6]。目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病原因及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并不十分清楚，但普遍認(rèn)為其是一個(gè)涉及多個(gè)基因多個(gè)步驟的分子生物學(xué)過(guò)程，包括多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活。

Id-2是1990年由Benezra等[7]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌基因，初期的研究結(jié)果認(rèn)為其與腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂有關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Id-2同時(shí)具有細(xì)胞周期調(diào)控和抑制細(xì)胞凋亡的功能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中Id-2呈現(xiàn)高表達(dá)而在對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞或正常組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，提示其在實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[8]。楊維群等[9]采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了122例食管鱗狀細(xì)胞癌及90例癌旁正常組織中Id-2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌中Id-2表達(dá)高于癌旁正常組織，且其陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的分化程度和浸潤(rùn)深度有關(guān)。因而，該研究認(rèn)為Id-2是食管鱗癌一個(gè)重要的分子學(xué)改變，Id-2可作為判斷食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的潛在指標(biāo)。單鐵英等[10]探討了直腸癌組織中Id-2表達(dá)與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，該研究提示Id-2表達(dá)水平與直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系，直腸癌組織中Id-2高表達(dá)可能是通過(guò)MMP-9途徑來(lái)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中Id-2陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且陽(yáng)性表達(dá)患者中低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例高于陰性患者，提示Id-2可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，這與單鐵英等[10]的研究結(jié)論基本一致。同時(shí)我們根據(jù)患者腫瘤組織中Id-2的表達(dá)水平分為陰性組和陽(yáng)性組，并采用Kaplan-meier風(fēng)險(xiǎn)比例模型探討了Id-2表達(dá)水平與患者無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性患者中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間顯著低于陰性組，提示Id-2陽(yáng)性患者預(yù)后不良，可作為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的生物學(xué)指標(biāo)。

Id-2參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移已被多個(gè)研究證實(shí)，但其調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制并不清楚。因此，應(yīng)進(jìn)一步以各種實(shí)體腫瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，綜合采用多種分子生物學(xué)技術(shù)，在分子水平和體內(nèi)探討其調(diào)控細(xì)胞和生物體惡性表型的分子機(jī)制，為臨床結(jié)直腸腫瘤靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

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Clinical significance of inhibitor of differentiation 2 expression in colorectal cancer.

HAN Yun1,WANG Qiang2. Department of Oncology1,Department of Clinical Laboratory2,Shifang People's Hospital,Shifan 618400,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the association between inhibitor of differentiation 2(Id2)expression and clinical characteristic in patients with colorectal cancer.MethodsFifty-six patients with colorectal cancer,who underwent surgery in our hospital from Jan 2013 to Jun 2015,were enrolled in this study.The Id2 expression of 56 cases of cancer tissue and 26 cases of normal tissue were tested by immunohistochemistry.The associations between inhibitor of differentiation 2 expression and age,gender,pathology grading lymph node metastasis and prognosis in colorectal patients were analyzed.ResultsThe immunohistochemistry showed that Id2 was general expressed in the cytolymph.The positive expression rate of Id2 in cancer tissue[64.3%(36/56)]was significantly higher than that in normal tissue [34.6%(9/26)],P＜0.05.Clinical pathological features analysis showed a significant association between Id2 positive expression and clinical stage(P＜0.05),pathology grading(P＜0.05),lymph node metastasis(P＜0.05).The proportion of poor differentiation,stageⅢ～Ⅳ,lymph node metastasis in Id2 positive expression patients was significantly higher than those in negative expression patients(P＜0.05).The median survival time of disease progression in Id2 positive patients (24.7 months)was significantly lower than that in Id2 negative patients(38.5 months),P＜0.05.ConclusionId2 may play an important role in the development of colorectal cancer,which could be a biomarker for prognosis.

Colorectal cancer;Inhibitor of differentiation 2(Id2);Immunohistochemistry;Clinical characteristics;Survival time

R735

A

1003—6350（2016）14—2246—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.004

2016-01-12)

四川省德陽(yáng)市2014年度重點(diǎn)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2014SZ100-2）

韓蕓。E-mail：huanyun_sf@sina.com