吳鴻雁，黃　睿，熊亞莉，陳　錦，孫珍花，王貴陽(yáng)，吳　超

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·論著·

不同病因慢性肝病患者肝組織中IL-10的表達(dá)及意義

吳鴻雁1，黃睿2，熊亞莉2，陳錦1，孫珍花2，王貴陽(yáng)2，吳超2

210008江蘇南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院,1. 病理科,2. 感染科

[摘要]目的探討不同病因的慢性肝病(CLD)患者肝組織中白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)及其與肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系。方法收集93例CLD患者及23例正常對(duì)照肝組織石蠟標(biāo)本，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中IL-10的表達(dá)。結(jié)果不同病因的CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)均較正常對(duì)照明顯增高(P<0.01)。隨著肝臟炎癥分級(jí)(G)的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著肝臟纖維化程度分期(S)的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)亦逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IL-10可能參與CLD患者肝臟的炎癥和纖維化的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]慢性肝??；白細(xì)胞介素-10；炎癥；肝纖維化

慢性肝病(chronic liver diseases, CLD)包括病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等，?？蛇M(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌，甚至死亡，嚴(yán)重影響健康。研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)在介導(dǎo)CLD的肝損傷及纖維化中發(fā)揮重要的作用[1]。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)是T淋巴細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞、輔助性T 淋巴細(xì)胞2(Th2)等分泌的重要抗炎細(xì)胞因子。但其是否參與CLD患者肝組織炎癥和纖維化的發(fā)生尚不完全清楚。本研究擬檢測(cè)不同病因CLD患者肝組織中IL-10的表達(dá)，探討各種CLD患者肝組織的IL-10表達(dá)與其肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1病例選擇研究對(duì)象為2008年5月-2013年12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院接受肝穿刺活檢或者肝臟手術(shù)的CLD患者肝組織石蠟標(biāo)本。共入組93例CLD患者，其中男49例，女44例，中位年齡48(21～70)歲。其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)65例，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)7例，自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)14例，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)7例，同時(shí)納入23例肝移植的供肝標(biāo)本作為正常對(duì)照(healthy control, HC)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)患者年齡大于18歲，性別不限。所有患者均在我院明確診斷為CLD，其中CHB診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。ALD及AIH、PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)分別符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分學(xué)的《酒精性肝病診療指南》[3]和中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)的《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[4]。

1.3CLD患者肝組織炎癥分級(jí)和纖維化分期CLD患者肝組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，常規(guī)HE染色，根據(jù)CLD患者肝組織HE染色結(jié)果，由南京鼓樓醫(yī)院病理科有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師參照Scheuer提出的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CLD患者肝組織進(jìn)行炎癥分級(jí)和纖維化分期[5]。

1.4IL-10表達(dá)的檢測(cè)采用Envision 免疫組化法檢測(cè)CLD患者肝組織中IL-10的表達(dá)部位及水平。將肝組織蠟塊切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將切片置于EDTA(pH9.0)中行高壓熱修復(fù)，自然冷卻，PBS沖洗2次，滴加抗IL-10抗體(美國(guó)Abcam公司)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS沖洗2次，滴加二抗(美國(guó)Invitrogen公司)后室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封固。

1.5結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)由南京鼓樓醫(yī)院病理科有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師盲法對(duì)CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)分別進(jìn)行評(píng)分，采用染色強(qiáng)度乘以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的方法綜合評(píng)分法，陽(yáng)性數(shù)量評(píng)分：< 5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃著色為1分，黃色為2分，棕黃著色為3分。兩者相乘即為該樣本的IL-10得分[6]。

2結(jié)果

2.1不同病因CLD患者肝組織IL-10表達(dá)對(duì)不同病因所致CLD患者肝組織內(nèi)IL-10的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照肝組織中僅有少量的IL-10的表達(dá)，而CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)均有大量的IL-10的表達(dá)(圖1)。統(tǒng)計(jì)分析表明，CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)均較正常對(duì)照明顯增高(P<0.001，圖2)。對(duì)不同病因的CLD患者肝組織中IL-10的表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10表達(dá)均較正常對(duì)照肝組織明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而不同病因的CLD患者IL-10表達(dá)無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖3)。

2.2CLD患者肝組織中IL-10表達(dá)與肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系為分析IL-10表達(dá)與CLD患者肝組織炎癥和纖維化程度的關(guān)系，對(duì)不同炎癥分級(jí)(G)和纖維化分期(S)的CLD患者肝組織內(nèi)IL-10表達(dá)進(jìn)行了分析。如圖4所示，不論肝小葉或是匯管區(qū)，隨著G分級(jí)的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G4期的患者IL-10評(píng)分略低于G3期，考慮與G4期患者樣本較少有關(guān)。隨著S分期的增高，CLD患者肝組織肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達(dá)亦呈逐漸增高的趨勢(shì)(圖5)。

3討論

IL-10是最早由Mosmann等發(fā)現(xiàn)的由T淋巴細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞、Th2等細(xì)胞產(chǎn)生的重要免疫抑制因子[7]。IL-10有廣泛的免疫抑制活性，可抑制T細(xì)胞增殖、抑制抗原提呈，抑制巨噬細(xì)胞活化等[7]，能夠限制過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)組織器官造成的損害[8]。

在肝臟中許多細(xì)胞都能分泌IL-10，包括肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)以及淋巴細(xì)胞等[9-10]。既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)表明，IL-10可能參與肝損傷和纖維化的發(fā)生。Poovorawan等[11]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性的CHB患者血清中IL-10的水平與其肝組織炎癥壞死程度及纖維化程度呈明顯的正相關(guān)。Lian等[12]研究也發(fā)現(xiàn)CHB患者血清IL-10水平較正常對(duì)照明顯增高，且與患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amiotransferase, ALT)水平呈明顯的正相關(guān)，提示IL-10參與CHB患者肝損傷。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清IL-10明顯增高，且與血清ALT正相關(guān)。對(duì)于IL-10在CLD患者肝組織中的表達(dá)情況及其與肝組織炎癥程度和纖維化程度的關(guān)系報(bào)道較少。本研究對(duì)不同病因的CLD患者肝組織中IL-10表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同病因的CLD患者肝組織中IL-10表達(dá)較正常對(duì)照明顯增高。CLD患者肝組織中IL-10表達(dá)與肝組織炎癥及纖維化程度均呈明顯的正相關(guān)，提示IL-10參與CLD患者的肝組織炎癥和纖維化。

CLD患者肝組織中IL-10增高的原因尚不完全清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化小鼠肝組織中IL-10的表達(dá)明顯增高，提示IL-10參與肝損傷及肝纖維化的發(fā)生[14]。然而IL-10缺陷的小鼠CCl4誘導(dǎo)的肝損傷及纖維化的程度卻較野生型明顯嚴(yán)重[15-16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)給予外源性IL-10能夠明顯減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織炎癥程度和肝纖維化程度[17]，同時(shí)能減輕肝星狀細(xì)胞的活化，促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡[18]。因此，推測(cè)CLD患者肝組織中IL-10的增高，可能是機(jī)體為了限制過(guò)強(qiáng)的免疫導(dǎo)致的肝組織炎癥和纖維化的發(fā)生。

總之，本研究提示IL-10參與CLD患者的肝臟炎癥和纖維化，但其肝組織中IL-10具體來(lái)源及調(diào)控機(jī)制尚不完全明確[19-20]。因此，進(jìn)一步明確IL-10在CLD肝組織中的來(lái)源及其具體的調(diào)控機(jī)制，將有利于明確CLD的發(fā)病機(jī)制，從而尋找有效的治療CLD的新方法。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Expression of interleukin-10 in the liver tissues of patients with chronic liver diseases of different etiologies

WU Hong-yan1, HUANG Rui2, XIONG Ya-li2,CHENJin1,SUNZhen-hua2,WANGGui-yang2,WUChao2.

1.DepartmentofPathology, 2.DepartmentofInfectiousDiseases,NanjingDrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing,Jiangsu210008,China

[Key words]chronic liver disease; interleukin-10; inflammation; liver fibrosis

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of interleukin-10 (IL-10) in the liver tissues of patients with chronic liver diseases (CLD) and determine its association with liver inflammation and liver fibrosis. MethodsA total of 93 patients with different types of CLD were enrolled in our study. Twenty-three normal liver tissues were included as control. The expression of IL-10 was determined by immunohistochemistry in the formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissues of CLD patients and healthy controls. ResultsThe expression of IL-10 was significantly increased in both hepatic lobule and portal area of liver tissues of CLD patients with different etiologies as compared with normal controls (P<0.01). CLD patients with high inflammation grades (G) had higher IL-10 expression in hepatic lobule and portal area of liver tissues compared to those with lower grades. Significantly higher IL-10 expression was found in hepatic lobule and portal area of liver tissues of CLD patients with high fibrotic stages (S) compared to those with lower stages. ConclusionIL-10 may play a pathological role in chronic liver inflammation and fibrosis in CLD.

基金項(xiàng)目：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(YKK13065)

通訊作者：熊亞莉，E-mail: yaya-mei@sohu.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R575

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.02.004

(收稿日期：2015-07-10;修回日期：2015-10-19)

引用格式：吳鴻雁，黃睿，熊亞莉,等.不同病因慢性肝病患者肝組織中IL-10的表達(dá)及意義[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(2):122-124,141.