孫 茹

（阜新市細(xì)河區(qū)疾病預(yù)防控制中心 遼寧 阜新 123000）

流行性腦膜炎又叫做流行性腦脊髓膜炎，簡稱流腦。此病是由腦膜炎奈瑟氏菌通過呼吸道傳播引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。此病起病急驟，傳播迅速，致死率較高，可嚴(yán)重威脅患者的生命安全。此病患者可出現(xiàn)低熱、頭痛、嘔吐、皮膚淤斑等臨床表現(xiàn)?；颊呷粑吹玫郊皶r(shí)有效的治療，極有可能引發(fā)敗血癥性休克、腦實(shí)質(zhì)損害等嚴(yán)重的并發(fā)癥，進(jìn)而導(dǎo)致其死亡。因此，對(duì)流行性腦膜炎患者進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷對(duì)挽救其生命具有重要的意義。過去，臨床上多單純采用細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌，但效果一般[2]。我院選取了在我院進(jìn)行體檢的438例受檢者，對(duì)其聯(lián)用普通PCR 法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌，取得了很好的效果?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究的對(duì)象為2013年11月至2015年11月期間來我院進(jìn)行體檢的438例受檢者。在這438例受檢者中，有男性受檢者221例，女性受檢者217例。他們的年齡在12歲～58歲之間，平均年齡為（35.4±21.5）歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 使用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè) 用無菌棉拭子擦拭受檢者懸雍垂后的鼻咽部黏膜處的分泌物進(jìn)行標(biāo)本采集。采用前期預(yù)熱的雙抗巧克力瓊脂血平板對(duì)采集到的標(biāo)本進(jìn)行接種，并在保溫狀態(tài)下送至檢驗(yàn)室。檢驗(yàn)人員將平板放置于含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將溫度設(shè)置為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18～24小時(shí)。然后挑選出灰白色、半透明的、濕潤的、直徑為1～2 mm的菌落，對(duì)其進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為18～24小時(shí)。完成培養(yǎng)后進(jìn)行涂片染色處理，再進(jìn)行鏡檢。在鏡檢中若發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌，檢驗(yàn)人員需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離鑒定。若進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈陽性，需要繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)。

1.2.2 聯(lián)用普通PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè) 采集標(biāo)本后，立刻將標(biāo)本置于預(yù)熱的雙抗巧克力瓊脂血平板中進(jìn)行接種，并在保溫狀態(tài)下送至檢驗(yàn)室。將平板放置于溫度為37℃的含有5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為18～24小時(shí)。挑選出灰白色、半透明的、濕潤的、直徑為1～2 mm的菌落，對(duì)其進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為18～24小時(shí)。然后，進(jìn)行涂片染色處理，再進(jìn)行鏡檢。對(duì)鏡檢中發(fā)現(xiàn)的革蘭陰性雙球菌進(jìn)一步進(jìn)行分離鑒定。對(duì)進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈陽性者，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)。采用水煮法提取腦膜炎奈瑟氏菌的DNA模板。操作方法是：從培養(yǎng)平板上取出一定量符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株，使其懸浮在100～200 μL的純水上，加熱煮沸。持續(xù)20分鐘后，進(jìn)行離心處理。以1000 rpm（轉(zhuǎn)/分鐘）的速度離心5分鐘，然后吸出上清液作為DNA模板。使用PCR儀對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR試驗(yàn)，PCR的反應(yīng)體系為：10 μL2×PCR Pre-Mix、2μL上游引物、2μL下游引物、4μL純水、2μL DNA模板，其反應(yīng)體積為20 μL，其循環(huán)條件為：94℃變性5 min→94℃變性30 sec→55℃變性30 sec→72℃變性45 sec→返回第二步循環(huán)35個(gè)循環(huán)→72℃變性5 min。用1.0%的瓊脂糖對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌進(jìn)行分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 我們采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用X2檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，在438例受檢者的標(biāo)本中，共檢出7株腦膜炎奈瑟氏菌，其中有3株B群，2株C群，1株X群，血清中出現(xiàn)1株不可分群的流腦菌株，其檢出率為1.60%。聯(lián)用普通PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，在438例受檢者的標(biāo)本中，共檢出10株腦膜炎奈瑟氏菌，其中有5株B群，2株C群，2株X群，1株W135群，不存在不可分群現(xiàn)象，其檢出率為2.28%。聯(lián)用普通PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的檢出率高于單純使用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)的檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

流行性腦膜炎起病急驟，傳播迅速，此病患者若未得到及時(shí)有效的治療，極有可能引發(fā)敗血癥性休克、腦實(shí)質(zhì)損害等嚴(yán)重的并發(fā)癥，進(jìn)而威脅患者的生命安全。因此，對(duì)流行性腦膜炎患者進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷對(duì)挽救其生命具有重要的意義。過去，臨床上多單純采用細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌。該檢測(cè)方法效果一般，且患者若在治療的過程中使用抗生素，可使患者的血培養(yǎng)結(jié)果呈陰性，此時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)法無法有效地將菌株分離出來，從而會(huì)降低檢出率[3,4]。近年來，隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCR技術(shù)開始應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)中。且使用普通PCR法進(jìn)行檢測(cè)在2～4小時(shí)內(nèi)就能得到檢測(cè)結(jié)果，快速、有效[5]。本次研究的結(jié)果顯示，單純使用細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的檢出率為1.60%，聯(lián)用普通 PCR 法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌的檢出率為2.28%，這說明聯(lián)用普通PCR 法與細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌進(jìn)行檢測(cè)可以有效地提高該菌的檢出率。單純使用細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)檢出3株B群、2株C群、1株X群，與聯(lián)用普通 PCR 法和細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌進(jìn)行檢測(cè)的分型結(jié)果完全相符。單純使用細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)了1株不可分群的流腦菌株，聯(lián)用普通 PCR 法與細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)分群出W135。這可能是因?yàn)檫@部分菌株存在群特異性基因，群特異性基因擴(kuò)增使檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為陽性，但該基因中存在缺失、滑移錯(cuò)配及插入情況，使其莢膜不能正常表達(dá)，因此在血清中不能分群[6]。

綜上所述，聯(lián)用普通PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)腦膜炎奈瑟氏菌可有效地提高其檢出率。此檢測(cè)方法值得在臨床上推廣應(yīng)用。

[1] 郭琍,黃志峰,任結(jié)梅.廣東省近兩年流行性腦膜炎奈瑟氏菌菌群分布及藥敏性結(jié)果分析[J].今日藥學(xué),2011,21（12）:764-765.

[2] 朱宏飛.腦膜炎奈瑟氏菌莢膜抗原基因簇的研究和遺傳分型方法的建立[D].南開大學(xué)，2012.

[3] 陳航,方瑾.腦膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A的克隆表達(dá)及血清學(xué)分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29（04）:414-417.

[4] 吳蘇宏,郭月麗,李曲文.腦膜炎奈瑟氏菌B群引起一例新生兒流腦的實(shí)驗(yàn)室診斷及流行病學(xué)調(diào)查[J].教育教學(xué)論壇,2013,05（46）:154-155.

[5] 鄭鑫.腦膜炎奈瑟氏菌表面蛋白NspA基因的克隆與原核表達(dá)[D].長春理工大學(xué),2011.

[6] 黃明明,鄒玲,劉文華,等.水貂腦膜炎奈瑟氏菌感染的診斷及藥敏試驗(yàn)[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2014,36（01）:41-43，46.