廖文英　康潔　陳育芬　劉朝富

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非編碼RNA與肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展

廖文英康潔陳育芬劉朝富

521000廣東潮州解放軍第一八八醫(yī)院腫瘤科

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上的常見惡性腫瘤之一，也是第三大導(dǎo)致癌癥病死的原因[1]。由于缺少有效的治療措施，晚期HCC常常導(dǎo)致患者快速死亡。與其它多種惡性腫瘤相似，HCC的發(fā)生中存在著多種基因網(wǎng)絡(luò)及信號通路的調(diào)控異常。這些改變的基因包括可編碼蛋白質(zhì)的基因及非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。近年來，隨著對微小RNA(micro-RNA，miRNA)研究的深入，逐漸認(rèn)識到包括miRNA在內(nèi)的ncRNA在HCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演著十分重要的角色。ncRNA是一種不翻譯為蛋白質(zhì)的功能性RNA，人類的基因組中只有不足2%的基因序列最終翻譯為功能性蛋白質(zhì)，其他很大比例是轉(zhuǎn)錄為ncRNA，并通過多種途徑直接發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。ncRNA具有多種類型，且不同類型的轉(zhuǎn)錄譜是存在著巨大差異的。同時，人基因組編碼的ncRNA數(shù)量仍屬未知，也不斷有研究發(fā)現(xiàn)全新的功能性ncRNA[3]。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，lncRNA)是大小超過200個核苷酸長度的ncRNA。雖然與microRNA相比其生物學(xué)功能尚不明確，但是越來越多的研究顯示lncRNA可通過多種機(jī)制來干預(yù)相關(guān)基因的表達(dá)。在HCC中，ncRNA作為致病、診斷、預(yù)后及治療相關(guān)的研究靶點也逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。在此，我們對ncRNA與HCC的關(guān)系進(jìn)行簡要的綜述。

一、HCC的發(fā)生與ncRNA

miRNA是由約22個核苷酸組成的小分子ncRNA，主要通過抑制靶標(biāo)miRNA轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)3′未翻譯區(qū)(UTRs)的轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)序列降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。目前，隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)人類基因組中約有2 000個miRNA，并參與調(diào)節(jié)約30 000個基因的表達(dá)及蛋白合成[5]。其中許多miRNA已被證明在正常細(xì)胞功能中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]。人類癌細(xì)胞基因組中常常存在miRNA的表達(dá)改變，而且與癌癥的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。miRNA與多種促進(jìn)惡性腫瘤的生物學(xué)過程相關(guān)，如：凋亡、增殖、血管新生、對信號通路的控制等。大量的研究數(shù)據(jù)顯示，HCC的發(fā)生類似其他惡性腫瘤，經(jīng)由miRNA影響抑癌及促癌基因的表達(dá)來促進(jìn)HCC的發(fā)生[7]。HCC中最顯著的異常表達(dá)miRNA包括起上調(diào)作用的miR-221、miR-21、miR-18等，以及起下調(diào)作用的miR-122a、miR-199a、miR-200等[8, 9]。這些miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因與HCC的發(fā)生有潛在關(guān)系。

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是導(dǎo)致絕大多數(shù)HCC發(fā)生的原因。HBV DNA可整合至宿主基因組從而對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄進(jìn)行控制，增加肝細(xì)胞致癌的敏感性。miRNA可通過調(diào)節(jié)HBV本身的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)HBV感染，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生[10]。miR-18a的靶標(biāo)是雌激素受體α(ER-α)。Liu等[11]的研究顯示，在女性HBV感染者中miR-18a存在過量表達(dá)，支持了mir-18a通過ER-α調(diào)節(jié)的HBV轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時，Zhang等[12]也發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-152、miR-148或miR-1表達(dá)從而調(diào)節(jié)HDAC4來實現(xiàn)對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制可減弱HBV復(fù)制，從而降低HCC風(fēng)險。此外，miR-196可直接抑制HCV轉(zhuǎn)錄，從而減少HCC發(fā)生的風(fēng)險。HCC也可發(fā)生于非病毒性因素所致肝硬化，如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。酒精的攝入與miR-199、miR-200、miR-126等的表達(dá)降低相關(guān)，這些miRNA的異常表達(dá)也可在HCC中觀察到。HCC的另一個危險因素是NASH，已經(jīng)確證的是NASH可增高發(fā)生肝纖維化及HCC的風(fēng)險。Elton等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，在NASH相關(guān)的飲食模型的患者中，存在著miR-155表達(dá)上調(diào)。miR-155可以靶向作用于抑癌基因C/EBP β，同時還可下調(diào)HBV病毒的轉(zhuǎn)錄。

lncRNA的長度變化范圍較大，平均約為592個核苷酸，較mRNA更短(平均2453個核苷酸)[14]。大多數(shù)lncRNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與基因表達(dá)的后期調(diào)節(jié)，可使用如基因芯片或轉(zhuǎn)錄組分析等生物信息學(xué)技術(shù)檢出。近年來，逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNAs在基因表達(dá)及信號通路調(diào)節(jié)中有重要作用。與蛋白編碼基因相似，lncRNA是由染色質(zhì)標(biāo)記、獨立基因啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及多個外顯子拼接而成的成熟轉(zhuǎn)錄模板[15]。使用全基因組測序及二代測序技術(shù)在鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計的lncRNA轉(zhuǎn)錄，這些結(jié)果正逐步應(yīng)用于人ncRNA的研究。與其他RNA相似，lncRNA具有作為疾病或臨床應(yīng)答的生物學(xué)標(biāo)記的潛在作用。最新的研究顯示，lncRNA是多種惡性腫瘤的重要調(diào)節(jié)因子，如MALAT1(與轉(zhuǎn)移性肺腺癌相關(guān))、HOTAIR(HOX反轉(zhuǎn)錄基因RNA)、H19、 HULC(在HCC中顯著上調(diào))、PRNCR1(前列腺癌非編碼RNA1)等lncRNA在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中存在異常表達(dá)[16]。如Lai等[17]的研究顯示，MALAT1在HCC中明顯上調(diào)且中可促進(jìn)小鼠模型上HCC發(fā)生，提示其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。在HepG2細(xì)胞系中MALAT1的抑制可明顯減少癌細(xì)胞的生存力、活力及侵襲能力，并且增強(qiáng)癌細(xì)胞凋亡。另一種lncRNA——HOTAIR在HCC組織中的表達(dá)存在顯著上調(diào)，而且這種升高與HCC患者不良預(yù)后也存在相關(guān)性[18]。此外，HOTAIR還可下調(diào)RNA結(jié)合蛋白-38，促進(jìn)HCC中癌細(xì)胞的遷徙。H19基因編碼位于11p15.5上的一段2.3 kb lncRNA，其在母系等位基因上專項表達(dá)，并且與生長發(fā)育相關(guān)的基因突變相關(guān)[19]。HULC基因是位于染色體6p24.3上一段長556 bp的核苷酸序列，是最先被描述的在HCC中顯著上調(diào)的特異性lncRNA。Du等[20]的重要研究顯示，HBV的HBx蛋白可以通過抑制p18活性來增高HULC表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，在HCC的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。盡管lncRNA對多種重要功能基因的調(diào)節(jié)效應(yīng)較為確定及普遍，但是lncRNA在HCC和其他癌癥發(fā)生機(jī)制中所起的生物學(xué)作用尚待深入闡述。

二、ncRNA用于HCC的診斷及預(yù)后

大量的研究提示，miRNA作為疾病診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物有著十分重要的臨床意義。包括miRNA、lncRNA在內(nèi)的多種ncRNA已被證實在HCC或其他類型惡性腫瘤的外周循環(huán)或體液中存在著異常表達(dá)[21]。外周循環(huán)中的大部分miRNA存在于封閉的細(xì)胞外囊泡中，這種運輸方式與高密度脂蛋白及Argonaute 2蛋白等相關(guān)[22]。miRNA可被血液循環(huán)運輸?shù)讲煌课?，從而對不同靶組織發(fā)揮十分復(fù)雜多樣的生物學(xué)作用。Kogure等[23]的研究顯示，細(xì)胞外囊泡內(nèi)的miRNA可經(jīng)由HCC組織的細(xì)胞間質(zhì)因子作用而被癌細(xì)胞攝取，并發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能。而部分非囊泡運輸?shù)难h(huán) miRNA的功能效應(yīng)還未得到闡述，這類特殊的miRNA在HCC中發(fā)揮何種功能也仍屬未知。RNA分子通常不被被動機(jī)制攝取，而更傾向于通過內(nèi)源性核酸酶發(fā)生退化。因此，檢測在HCC中釋放的循環(huán)miRNA情況，可為疾病的診斷及預(yù)后提供重要參考。

慢性HBV及HCV感染是引起HCC的主要原因，篩查這些感染患者的HCC特異性生物標(biāo)記也具有重要臨床價值。HCV相關(guān)性HCC中可出現(xiàn)特異性的miR-100、miR-122、miR-221及miR-224表達(dá)顯著上調(diào)，也已有針對這類miRNA作為診斷標(biāo)志物的研究進(jìn)行[24]。循環(huán)miR-101也是HBV相關(guān)性HCC潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，與HCC病理分級及預(yù)后顯著相關(guān)[25]。此外，檢測HCC組織及循環(huán)中特定miRNA的表達(dá)也有助于HCC的預(yù)后判斷。HCC組織中多種miRNA存在異常表達(dá)，如：miR-199a、miR-199b-3p、miR-26及miR-29，且與患者遠(yuǎn)期生存有關(guān)[26]。此外，Zhang等[27]的研究還發(fā)現(xiàn)，HCC中miR-148b的表達(dá)降低也與生存預(yù)后差有關(guān)。Karakatsanis等[28]的研究顯示，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221及miR-222在 HCC組織中顯著上調(diào)，而且，miR-21、miR-31、miR-122、miR-221的表達(dá)上調(diào)與肝硬化發(fā)生相關(guān)，miR-21及miR-221與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)。但是這些研究大多數(shù)都只停留在對臨床現(xiàn)象及相關(guān)性的分析，仍缺少對miRNA與HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的更深入研究探討。

特定類型的惡性腫瘤可存在lncRNA的特異性表達(dá)，這也與miRNA相似，提示其也具有診斷、預(yù)后或作為治療靶點的潛在價值。如Ishibashi等[18]的研究顯示，高表達(dá)HOTAIR(一種lncRNA)的HCC患者較低表達(dá)或不表達(dá)HOTAIR患者預(yù)后更差，同時HOTAIR可預(yù)測HCC患者治療后的復(fù)發(fā)情況，體外細(xì)胞試驗也顯示HOTAIR表達(dá)上調(diào)可使癌細(xì)胞增殖更快。此外，HCC風(fēng)險與多種miRNA的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)相關(guān)，如miR-let-7與rs10877887、miR-101-1與rs7536540及miR-34b與rs4938723等[29, 30]。與HCC相關(guān)的lncRNA的SNP研究數(shù)據(jù)較少得到報道，但是與癌癥相關(guān)定位于非編碼區(qū)的SNP可通過lncRNA的轉(zhuǎn)錄異常表現(xiàn)出來[31]。然而多種ncRNA相關(guān)的SNP研究的結(jié)果并不一致，可能與研究的種族背景不同有關(guān)，ncRNA的差異性表達(dá)及功能改變是否與特定位點的SNP相關(guān)仍需更深入的研究。

三、靶向ncRNA的HCC治療

雖然外科手術(shù)或肝移植是HCC治療的最主要方法，但是大多數(shù)HCC患者診斷明確時即為晚期，無法進(jìn)行手術(shù)或移植，預(yù)后極差。針對這類患者的全身或局部治療可有效延緩HCC進(jìn)展。靶向HCC中的異常表達(dá)lncRNA，可能更好地用于區(qū)分對藥物治療敏感的患者，為臨床提供全新的治療方式。miRNA可能抑制多個基因的表達(dá)，從而調(diào)控與HCC生長相關(guān)的多個信號通路[32]。HCC中顯著表達(dá)的miRNA是miR-21，其過量表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)[33]。另一些其他miRNA，如：miR-151及miR-221/222在HCC患者中表達(dá)顯著增加，也可以作為介入治療的潛在靶點[34]。同樣，通過調(diào)節(jié)HCC中干擾抑癌基因的miRNA的方法，也是阻止HCC惡化的有效方法。Chen等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，使用特異性抗體來沉默miR-221表達(dá)，可阻止原位癌動物模型腫瘤的進(jìn)展，增加總體存活率。因此，沉默miR-221可減少HCC中癌細(xì)胞的擴(kuò)散，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致惡性細(xì)胞復(fù)制周期終止。

病毒感染的前提與HCC的發(fā)生有特定關(guān)系，治療調(diào)整與肝炎病毒和HCC相關(guān)的ncRNA的表達(dá)，可能潛在減緩疾病進(jìn)展及HCC的發(fā)生。Diaz等[24]的研究發(fā)現(xiàn)HCV相關(guān)HCC中特異性表達(dá)18種 miRNA，與其它肝病相比具有高度特異性，未來靶向這些miRNA可能有助于預(yù)防甚至治療HCV相關(guān)HCC。miR-122是肝細(xì)胞特異性miRNA，通過與HCV基因5′-UTR上兩個關(guān)聯(lián)位點的相互作用，調(diào)節(jié)HCV RNA的穩(wěn)定性，從而刺激HCV復(fù)制。因此，miR-122在慢性HCV感染中的靶向治療極具吸引力。I、 II期臨床試驗使用miR-122寡核苷酸抗體靶向結(jié)合miR-122，顯示了對HCV復(fù)制的強(qiáng)效抑制性及安全性[36]。一個交替的辦法是使用小分子來調(diào)節(jié)HCV中的miR-122。目前有多種方法可用于miRNA表達(dá)的調(diào)控，包括抑制miRNA及替換miRNA，從而調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因的表達(dá)。miRNA替換在miRNA折疊時完成，而通過siRNAs可靶向抑制miRNA表達(dá)。此外，通過導(dǎo)入具有多靶向miRNA結(jié)合位點的載體，可以作為底物競爭性抑制靶向miRNA表達(dá)[37]。lncRNA也表現(xiàn)出作為治療靶點的潛在價值。H19作為一類具有致癌lncRNA，在HCC中存在高表達(dá)。靶向H19治療已在在患有胰腺、膀胱、卵巢腫瘤患者中進(jìn)行評估，用于HCC的研究也獲得了批準(zhǔn)。調(diào)節(jié)干預(yù)HCC相關(guān)lncRNA表達(dá)的方法與前面描述的miRNA的方法類似。相較其他類型的腫瘤，以miRNA或lncRNA為靶點的相關(guān)療法在HCC中的應(yīng)用研究更為廣泛及重要。但是基于這些方法的藥物仍在研究中，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的過程仍相對漫長。

四、問題及展望

總的來說，目前大量的研究獲得了與HCC相關(guān)的ncRNA的數(shù)據(jù)信息，且以miRNA為主，其他如lncRNA相關(guān)的研究也在不斷拓展中。這類ncRNA的共同特征是在HCC中異常表達(dá)，并具有作為HCC診斷、預(yù)后及治療生物學(xué)標(biāo)志物的潛在價值。對ncRNAs參與的HCC相關(guān)分子機(jī)制的深入研究，有助于確定更佳的治療靶點來控制腫瘤的形成及進(jìn)展。同時，也需要更完善的研究來改進(jìn)靶向ncRNA的HCC治療方法。

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(本文編輯：張苗)

通信作者：劉朝富，Email：liuchaofu2007@sina.com

(收稿日期：2015-12-23)