陳尚武 綜述，李青華 審校

(廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣人民醫(yī)院檢驗科　543300)

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·綜述·

同型半胱氨酸檢測技術(shù)的研究進展

陳尚武 綜述，李青華 審校

(廣西壯族自治區(qū)梧州市藤縣人民醫(yī)院檢驗科543300)

同型半胱氨酸；色譜技術(shù)；酶法分析技術(shù)；熒光偏振免疫分析法；熒光探針檢測技術(shù)

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸去甲基后形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物[1]。血漿Hcy是一個總稱，包括還原型Hcy，雙硫Hcy，混合雙硫半胱氨酸-Hcy和混合雙硫蛋白質(zhì)-Hcy，正常情況下游離Hcy較少，主要以蛋白質(zhì)形式存在[2]。

Mccully[3]描述Hcy尿毒癥患者的血管病變特征，患者的代謝障礙在任何階段，Hcy是引起臨床表現(xiàn)的原因，由此提出Hcy可能與動脈粥樣硬化有關(guān)。Lcken首次報道冠心病患者存在Hcy代謝障礙。Kang等發(fā)現(xiàn)MTHFR與Hcy代謝有關(guān)。相關(guān)臨床資料顯示Hcy是冠心病的一個新的獨立危險因素，可作為心腦血管病、腎臟病、老年癡呆與帕金森癥、妊娠合并癥、先兆子癇與不良事件的預(yù)測指標，是近年來醫(yī)學(xué)研究的新熱點。Hcy的檢測方法也不斷更新，現(xiàn)就Hcy的檢測技術(shù)綜述如下。

1　Hcy概述

Hcy于1932年由Vincent Du Vigheaud發(fā)現(xiàn)，分子式為C4H9NO5S，來源于蛋氨酸，由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成。合成途徑為蛋氨酸在ATP參與下，由蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)催化，生成S-腺苷蛋氨酸(SAM)，SAM又經(jīng)Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)催化，去甲基生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，接著由SAH水解酶催化生成Hcy。

Hcy在體內(nèi)的代謝：(1)Hcy在胱硫醚縮合酶(CBS)的催化下與絲氨酸縮合成胱硫醚，胱硫醚又由胱硫醚酶催化生成半胱氨酸和α酮丁酸，代謝產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán)或由尿液排出，2步轉(zhuǎn)化均需維生素B6參與或經(jīng)氧化結(jié)合生成高胱氨酸。(2)Hcy可在葉酸和維生素B12的輔助下甲基化重新合成甲硫氨酸，此過程需要甲硫氨酸合成酶(MS)催化，且須有N5-甲基四氫葉酸(THF)作為甲基供體。(3)釋放到細胞外液。凡是涉及Hcy代謝的各種酶和輔助因子異常均可導(dǎo)致血液中總同型半胱氨酸的增加而形成高同型半胱氨酸血癥。高同型半胱氨酸與老年性癡呆、腎病、糖尿病、妊娠相關(guān)病(如子癇、先天缺陷、死胎、流產(chǎn))等相關(guān)。因此，檢測Hcy具有重要的臨床意義。

2　Hcy檢測技術(shù)

2.1色譜技術(shù)1901年俄國植物學(xué)家Tswett在進行植物色素的分離試驗發(fā)明，“色譜法”一詞最早正式出現(xiàn)在《葉綠素的物理化學(xué)研究》和《吸附分析與色譜法》這2篇論文中[4]。色譜法根據(jù)分離原理的不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜；根據(jù)固定相的不同可分為柱色譜、薄層色譜、紙色譜；根據(jù)流動相物態(tài)的不同分為氣相色譜和液相色譜。應(yīng)用色譜法檢測Hcy主要有紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，由于質(zhì)譜(MS)技術(shù)的不斷成熟，Hcy由單一的色譜法發(fā)展到色譜與質(zhì)譜的連用檢測。

2.1.1薄層色譜法1962年Carson等[5]對患者的尿液進行化學(xué)分析，經(jīng)紙色譜進一步分析確定為Hcy。國內(nèi)利用薄層色譜技術(shù)檢測Hcy的報道在上世紀80～90年代較多，且大多數(shù)方法為吳有光等和閆英地等[6-10]的雙向薄層色譜法分析氨基酸，如利用微型雙向薄層色譜法檢測氨基酸代謝病，利用雙向展開劑，第1向展開劑為異丙醇-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-仲戊醇-氨水-水(9∶3∶3∶1∶1∶3∶3)，第2向展開劑為正丁醇-丙酮-異丙醇-甲酸-水(9∶4∶4∶1.5∶3),以鎘-茚三酮酸化丙酮溶液為顯色劑，通過與標準圖譜比對，定性檢測1例Hcy尿毒癥患者，雖然薄層掃描法可用于Hcy的定量檢測，但因該方法靈敏性低、重復(fù)性差、標本前處理操作繁瑣等原因，臨床未能得到普及[11]。

2.1.2氣相色譜法1987年Stabler等[12]首先報道GC-MS用于血漿Hcy檢測，該法首先在標本中加入內(nèi)標物，沉淀蛋白后上清液用離子交換柱色譜進行預(yù)處理，使用水復(fù)溶,衍生處理后進樣經(jīng)GC-MS分析,以保留時間和質(zhì)譜進行定性和定量。Myung等[13]應(yīng)用固相微萃取技術(shù)處理標本，采用GC-MS同時檢測樣品中的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸含量。有研究報道，將GC法聯(lián)合電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測血清總的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸，該法往樣品中加入硼氫化鈉打開二硫鍵，最終衍生成N-三氟乙酰-O-異丙酯衍生物進行測定[14]。雖然這些方法具有高度的精密性、靈敏性和專一性，但操作復(fù)雜,化學(xué)試劑毒性大，耗時長，難以適合常規(guī)臨床化學(xué)實驗室的使用，無法普及。

2.1.3液相色譜法根據(jù)檢測方法的不同又可分為紫外法(HPLC-UV)、熒光法(HPLC-FD)、示差折光法(HPLC-RID)、電化學(xué)法(HPLC-ED)等。HPLC-FD方法主要采用柱前或柱后衍生技術(shù)，然后通過HPLC將衍生物分離，并由熒光檢測器進行檢測。相關(guān)研究報道使用了這種方法[15-17]。HPLC-ED具有標本處理簡單,無需衍生化等特點,又具較高的靈敏性、專一性、穩(wěn)定性,應(yīng)用比較廣泛，文獻報道也比較多[18-19]。

近幾年研究表明較多的是HPLC-MS聯(lián)用方法，Espina等[20]建立高效液相色譜聯(lián)合電感耦合等離子體質(zhì)譜和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS-ESI-MS)法測定血清中游離Hcy；國內(nèi)還采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)聯(lián)合檢測血清中葉酸代謝物[21]，該法采用 BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，以甲酸-乙腈為流動相，流速為 0.4 mL/min， 進樣體積 5 μL，梯度洗脫，電噴霧正離子模式下以多反應(yīng)檢測(MRM) 方式，6 種葉酸代謝產(chǎn)物[葉酸、5-甲基四氫葉酸(5-MeTHF) 、5-甲酰四氫葉酸( 5-FoTHF)、Hcy、SAM、SAH] 分別在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，加樣回收率及日內(nèi)與日間精密度良好。

HPLC法是目前公認的高精密度的濃度檢測方法，具有特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點，色譜條件確定后一般均可獲得穩(wěn)定的結(jié)果。

2.2酶法分析技術(shù)酶法分析技術(shù)是以酶為試劑測定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑、抑制劑及酶偶聯(lián)法測定酶活性等的方法。由于酶作用的特異性高，成分復(fù)雜的血清等液體標本不需進行預(yù)處理就能檢測，極大簡化了實驗操作程序，試劑酶的本質(zhì)大多是蛋白質(zhì)，酶促反應(yīng)的條件溫和，無毒性，具有良好的應(yīng)用前景。

2.2.1酶循環(huán)法羅氏公司采用酶比色法測定血清Hcy，其原理為氧化型 Hcy首先被還原為游離 Hcy，然后在 Hcy S-甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，再與S-腺苷甲硫氨酸反應(yīng)形成甲硫氨酸(Met)和SAH。SAH的評估是通過一種偶聯(lián)的酶反應(yīng)，其中 SAH經(jīng) SAH 水解酶催化形成腺苷(Ado)和 Hcy ，而 Hcy 又循環(huán)進入 Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，形成的循環(huán)反應(yīng)擴大了檢測信號從而被檢測。

2.2.2酶轉(zhuǎn)換法原理為氧化型Hcy首先被還原劑還原為還原型Hcy，還原型Hcy隨后被分解，分解產(chǎn)物在氧化劑(如FeCl3)存在下與呈色劑二乙基對苯二胺硫酸鹽反應(yīng)形成甲基藍色化物，甲基藍色化物與標本Hcy的濃度呈正比，通過測定吸光度的變化值，即可檢測標本的Hcy總濃度。

眾多報道顯示酶法分析技術(shù)與熒光偏振免疫法(FPIA)及高效液相色譜法(HPLC)進行對比，各項指標均無明顯差異，酶法檢測血清Hcy具有操作簡單、精密度良好，線性范圍寬等諸多優(yōu)點，且結(jié)果準確，值得推廣[22-24]。

2.3FPIA法是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍偏振光(485 nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525 nm)。偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其(受激發(fā)時)轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的檢測。采用競爭反應(yīng)原理，在缺乏未標記分析物(通常是待測樣品)時熒光信號最強；加入未標記分析物后，在已標記和未標記標本之間的競爭將減弱熒光信號。熒光信號強度與游離的分析物濃度呈正比，與待測標本中未標記分析物的濃度呈反比。

FPIA法的優(yōu)點是靈敏度高，如檢測Digoxin的靈敏度可達0.2 ng/mL，精密度高、速度快、操作簡便，標本用量少，儀器不需每日校準。缺點是試劑盒專屬性強，儀器設(shè)備昂貴。

2.4熒光探針檢測技術(shù)熒光探針一般由熒光基團和識別基團通過連接基團連接而成。熒光基團具有大π鍵共軛體系,屬剛性平面結(jié)構(gòu),是發(fā)射熒光并通過儀器輸出電信號的信號基團。識別基團是通過絡(luò)合或(和)化學(xué)反應(yīng)與被分析物發(fā)生作用的部分。當(dāng)識別基團選擇性地與被分析物結(jié)合或反應(yīng)時,引起探針的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變,一般表現(xiàn)為熒光基團突光信號的增強或減弱。

Hcy、半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(GSH)等是生物體中主要的小分子生物硫醇化合物,在維持生物的正常生理活動中起重要作用。根據(jù)探針與生物硫醇化合物的反應(yīng)機制,可把探針分為2大類[25]。第1類主要是利用生物硫醇分子中巰基的親核性、還原性和金屬離子絡(luò)合能力與探針分子發(fā)生反應(yīng)。第2類熒光探針設(shè)計主要是利用熒光探針與生物醇中巰基和氨基官能團發(fā)生協(xié)同反應(yīng)。

探針檢測技術(shù)目前臨床應(yīng)用的報道非常少，但研究性文獻較多。Yang等[26]研究報道利用醛基探針檢測小分子生物硫醇化合物，該探針可選擇性地與硫醇化合物中的Hcy和半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，且成功應(yīng)用到生物成像中檢測低毒性的活細胞內(nèi)半胱氨酸和Hcy。不同物質(zhì)設(shè)計的熒光基團，與探針的反應(yīng)機制與也不相同，如以黃酮類、香豆素類、吡唑啉類物質(zhì)等。Xie等[27]研發(fā)設(shè)計的熒光探針基于醛基的環(huán)合反應(yīng)，通過抑制C=N鍵誘導(dǎo)分子內(nèi)氫鍵作用引起熒光淬滅而使吸收峰出現(xiàn)藍移(107 nm)，該機制已通過H1NMR譜和MS譜的分析驗證。Zhang等[28]基于黃酮類物質(zhì)設(shè)計的熒光探針對半胱氨酸和Hcy的靈敏度高。Dai等[29]采用醛基香豆素氯化物研發(fā)熒光探針，GSH、Hcy、半胱氨酸的檢測限分別是0.08、0.09、0.18 μmol/L。

熒光探針技術(shù)具有體積小、合成簡單、靈敏度高、選擇性好、可直接觀察等優(yōu)點。缺點：(1)一些熒光探針溶解在考察體系后，難以提取分離，不具備多次重復(fù)使用。(2)因一些小分子熒光探針的非水溶性與不良反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制。(3)小分子熒光探針難以制作成光學(xué)器械與光學(xué)儀器結(jié)合，無法實現(xiàn)自動化檢測。由于熒光探針的普適性不強，因此應(yīng)用受到較大限制。

3　小　　結(jié)

綜上所述，血漿或血清Hcy檢測可給臨床診斷或觀察提供必要的科學(xué)依據(jù)，檢測方法較多且各具特點，目前臨床主要以酶法分析技術(shù)為主，標本不需進行預(yù)處理，極大地簡化實驗操作程序，適應(yīng)臨床醫(yī)學(xué)實驗室的要求，值得臨床推廣應(yīng)用。

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