陳辰，趙凱亮，鄧文宏，余佳，郭聞一，張大興，王衛(wèi)星

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 4300600)

GSK-3β抑制劑LiCl干預(yù)大鼠重癥急性胰腺炎的量效關(guān)系

陳辰，趙凱亮，鄧文宏，余佳，郭聞一，張大興，王衛(wèi)星

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 4300600)

目的 探討糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制劑氯化鋰(LiCl)干預(yù)大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)的量效關(guān)系。方法50只SPF級雄性Wistar大鼠，按數(shù)字表法隨機(jī)分為五組(n=10)：假手術(shù)組(SO組)、重癥急性胰腺炎組(SAP組)、LiCl-40 mg/kg組、60 mg/kg組和80 mg/kg預(yù)處理組(LiCl組)。膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 mL/100 g)制備SAP大鼠模型；SO組在膽胰管內(nèi)注射等量生理鹽水替代?；悄懰徕c。LiCl組造模前30 min經(jīng)股靜脈注射相應(yīng)濃度LiCl。術(shù)后12 h分批處死大鼠，檢測血清淀粉酶(AMY)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、腹水量和肺濕干比。光鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行病理學(xué)評分。結(jié)果SAP組大鼠AMY、ALT、Cr、腹水量、肺濕干比、胰腺病理評分均較SO組升高[(7 224.14±1872.41)U/L vs(1 780.21±231.12)U/L、(250.56±51.56)U/L vs (98.45±10.36)U/L、(85±19)U/L vs(36±4)U/L、(11.05±2.76)g vs(0.33±0.04)g、(3.21±0.61)vs(1.60±0.20)、(11.52±1.23)分vs(0.54±0.02)分]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LiCl 60 mg/kg組上述指標(biāo)與SAP組相比較均有下降[(4 215.36± 940.24)U/Lvs(7 224.14±1872.41)U/L、(160.25±35.39)U/Lvs(250.56±51.56)U/L、(50±11)U/Lvs(85±19)U/L、(6.04±1.03)g vs(11.05±2.76)g、(2.70±0.54)vs(3.21±0.61)、(9.03±1.09)分vs(11.52±1.23)分]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而LiCl 40 mg/kg組AMY、腹水量、肺濕干比以及胰腺病理評分與SAP組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；LiCl-80 mg/kg組大鼠的ALT升高大于SAP組[(312.47±69.41)U/L vs(250.56±51.56)U/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Cr水平與SAP組比較[(79±17)U/L vs(85±19)U/L]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論LiCl-60 mg/kg是干預(yù)重癥急性胰腺炎大鼠模型最佳有效劑量。

Wistar大鼠；重癥急性胰腺炎；氯化鋰；劑量-效應(yīng)關(guān)系

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，約有20%的患者進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)，伴有胰腺和胰外臟器的損傷，致死率較高[1-2]。糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)主要參與機(jī)體糖原合成過程；除此之外，GSK-3β還可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)過程[3]，其作為炎癥干預(yù)靶點(diǎn)逐步受到重視。氯化鋰(LiCl)作為GSK-3β抑制劑，在大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)模型中的使用方法與劑量報(bào)道較少。本研究旨在探討靜脈給予LiCl干預(yù)大鼠SAP模型的量效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 LiCl選用Kingherb’s公司產(chǎn)品，使用10%DMSO(Sigma公司)溶解；?；悄懰徕c(STC)選用Sigma公司產(chǎn)品，使用無菌生理鹽水溶解。水合氯醛由武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科提供，生理鹽水溶解，配置濃度10%。

1.2 動(dòng)物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組 雄性SPF級Wistar大鼠50只，平均體重200～250 g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。使用數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)化分組，共5組(n=10)：假手術(shù)組(SO組)；重癥急性胰腺炎組(SAP組)；LiCl 40 mg/kg組、60 mg/kg組和80 mg/kg預(yù)處理組(LiCl組)。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水處理。重癥急性胰腺炎(SAP)造模使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉法麻醉(0.3 mL/100 g)。常規(guī)大鼠腹部消毒鋪巾，劍突下0.5 cm正中切口入腹，于肝臟下緣深部尋找十二指腸，穿刺針逆行經(jīng)十二指腸乳頭部入主胰管，注射STC溶液(濃度5%，0.1 mL/100 g，0.1 mL/min恒速)，注射后確認(rèn)胰腺組織出現(xiàn)明顯水腫及出血可認(rèn)為造模完成；假手術(shù)組(SO組)使用相同手法向胰腺注射等量生理鹽水。LiCl干預(yù)組于造模前30 min股靜脈注射法給予相應(yīng)劑量的LiCl溶液。造模后12 h分批處死大鼠，負(fù)壓下腔靜脈采血，離心血清備用。胰頭固定切片，右肺下葉測定濕干比，棉球復(fù)稱法測定腹水量。

1.3 指標(biāo)檢測 使用干棉球吸取腹水，復(fù)稱濕重減去干重即為腹水量。右肺下葉烤箱烘烤24 h后干重，肺濕干比(W/D)=肺濕重/肺干重。血清淀粉酶(AMY)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)均使用武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化儀檢測。胰腺病理切片光鏡下參照Schmidt J[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清AMY、ALT、Cr的變化 與SO組比較，SAP組AMY、ALT、Cr水平均明顯升高(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg組干預(yù)后，其AMY水平與SAP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而LiCl 60 mg/kg組和80 mg/kg組AMY水平對比SAP組明顯下降(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg組和60 mg/kg組ALT水平與SAP組比較明顯降低(P＜0.05)，而LiCl 80 mg/kg組ALT水平甚至高于SAP組(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg組和60 mg/kg組Cr水平與SAP組比較下降(P＜0.05)，LiCl 80 mg/kg組Cr水平與SAP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清AMY、ALT及Cr水平(±s)

表1 各組大鼠血清AMY、ALT及Cr水平(±s)

注：與SO組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05。

組別AMY（U/L）ALT(U/L)Cr(U/L) SO組SAP組LiCl-40 mg/kg組LiCl-60 mg/kg組LiCl-80 mg/kg組F值P值1780.21±231.12 7224.14±1872.41a7006.15±1610.31a4215.36±940.24ab4008.36±920.65ab44.15 .000 98.45±10.36 250.56±51.56a120.12±26.36b160.25±35.39ab312.47±69.41ab28.70 .000 36±4 85±19a40±9b50±11ab79±17a16.52 .000

2.2 各組大鼠腹水量、W/D、胰腺病理評分的變化 與SO組比較，SAP組腹水量明顯增加、W/D明顯升高(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg組干預(yù)后腹水量和W/D與SAP組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而LiCl 60 mg/kg組、80 mg/kg組干預(yù)后上述指標(biāo)均較SAP組明顯降低(P＜0.05)。與SAP組比較，LiCl 40 mg/kg組病理評分無明顯改變，而LiCl 60 mg/kg、80 mg/kg組干預(yù)后病理評分顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。SO組胰腺結(jié)構(gòu)大致正常；SAP組胰腺可見片狀壞死、間質(zhì)出血、腺葉間隙增寬及炎癥細(xì)胞浸潤；LiCl干預(yù)后上述病理改變有所緩解，見圖1。

表2 各組大鼠腹水量、W/D、胰腺病理評分的變化(±s)

表2 各組大鼠腹水量、W/D、胰腺病理評分的變化(±s)

注：與SO組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05。

組別 腹水量(g)W/D 胰腺病理評分SO組SAP組LiCl-40mg/kg組LiCl-60mg/kg組LiCl-80mg/kg組F值P值0.33±0.04 11.05±2.76a10.08±2.41a6.04±1.03ab6.60±1.65ab74.09 .000 1.60±0.20 3.21±0.61a2.80±0.56a2.70±0.54ab1.90±0.38b16.69 .000 0.54±0.02 11.52±1.23a10.81±2.01a9.03±1.09ab6.36±0.09ab75.27 .000

圖1 各組大鼠胰腺組織12 h病理改變(HE×400)

3 討 論

目前，鋰鹽在臨床上主要用于治療精神疾病，例如治療躁狂癥、雙相情感障礙、抑郁癥等[5]；但是近期的研究發(fā)現(xiàn)，鋰鹽還能發(fā)揮其他多種作用，例如在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型中，鋰鹽可以通過抑制GSK-3β、上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子表達(dá)、下調(diào)促凋亡因子、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞功能等多種途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。在肝臟和腎臟的缺血再灌注模型中，氯化鋰可通過減少細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等途徑，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[8-9]。因此，氯化鋰的這種“多靶點(diǎn)效應(yīng)”逐漸被人們關(guān)注，在多種疾病模型中被不斷深入研究。

GSK-3β主要參與機(jī)體糖原合成過程，隨著對其研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)GSK-3β還參與神經(jīng)保護(hù)、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)過程等過程[10]。有學(xué)者報(bào)道GSK-3β抑制劑TDZD-8可通過下調(diào)核因子-κB (NF-κB)和白介素-1(IL-1)的表達(dá)，緩解由蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎胰腺組織損傷[11]。因此，我們推測氯化鋰作為GSK-3β的抑制劑，也可能對急性胰腺炎的損傷有保護(hù)作用，但其干預(yù)的劑量文獻(xiàn)報(bào)道較少。為此，本文主要探討氯化鋰干預(yù)急性胰腺炎模型的量效關(guān)系，為下一步深入研究其具體作用機(jī)制提供依據(jù)。

我們參考相關(guān)文獻(xiàn)劑量[12]，在本研究中設(shè)立了40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg三個(gè)劑量梯度。結(jié)果顯示與SAP組比較，低劑量氯化鋰(40 mg/kg)未能有效改善胰腺損傷的病情；中高劑量氯化鋰(60 mg/kg、80 mg/kg)能顯著降低血清AMY水平和胰腺損傷的病理評分。進(jìn)一步分析顯示過高劑量的氯化鋰(80 mg/kg)干預(yù)，可導(dǎo)致肝腎功能的損傷，表現(xiàn)為ALT和Cr水平升高，其中ALT甚至高于SAP組。而中等劑量氯化鋰(60 mg/kg)干預(yù)后可以降低ALT和Cr水平、減少腹水量，降低肺濕干比，與SAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。依據(jù)上述結(jié)果，我們認(rèn)為靜脈注射氯化鋰60 mg/kg后，可有效緩解重癥急性胰腺炎胰腺損傷，減少腹水量、降低肺濕干比，該劑量是干預(yù)SAP大鼠模型的最佳有效劑量。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)胰腺外科學(xué)組.急性胰腺炎診治指南(2014) [J].中國實(shí)用外科雜志,2015,35(1):4-7.

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Dose-effect relationship of LiCl,an inhibitor of GSK-3β,on severe acute pancreatitis in rats.

CHEN Chen,ZHAO Kai-liang,DENG Wen-hong,YU Jia,GUO Wen-yi,ZHANG Da-xing,WANG Wei-xing.Department of Hepatobiliary and Laparoscopic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Key Laboratory of Hubei Province for Digestive System Diseases, Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate dose-effect relationship of LiCl,an inhibitor of GSK-3β,on severe acute pancreatitis in rats.MethodsFifty male Wistar rats were randomly divided into 5 groups(n=10)by digital table method:sham operation group(SO group),severe acute pancreatitis model group(SAP group),different dosage LiCl pretreatment groups(40 mg/kg,60 mg/kg and 80 mg/kg).SAP model was induced by retrograde infusion of 5%sodium taurocholate(0.1 ml/100 g)into the biliopancreatic duct.In SO group,the same amount of normal saline(NS)was infused into bilio-pancreatic duct instead of sodium taurocholate.Various doses(40 mg/kg,60 mg/kg and 80 mg/kg)of LiCl solution were administered via femoral vein 30 min before the SAP induction in LiCI pretreatment groups.Rats were killed at 12 h after operation,and the levels of serum amylase(AMY),alanine transarninase(ALT),creatinine(Cr),ascites, lung wet/dry weight ratio were measured in all groups.Pancreatic tissue was observed under the light microscope and pathological score was evaluated.ResultsThe levels of AMY,ALT,Cr,ascites,lung wet/dry weight ratio,and pancreatic pathological score in SAP group were significantly higher than SO group(7224.14±1872.41)vs(1780.21±231.12)U/L, (250.56±51.56)vs(98.45±10.36)U/L,(85±19)vs(36±4)U/L,(11.05±2.76)vs(0.33±0.04)g,(3.21±0.61)vs(1.60±0.20), (11.52±1.23)vs(0.54±0.02)(P＜0.05).Compared with SAP group,60 mg/kg dosage of LiCl had the best effect on improving all the indexes(4215.36±940.24)vs(7224.14±1872.41)U/L,(160.25±35.39)vs(250.56±51.56)U/L,(50±11)vs(85±19)U/ L,(6.04±1.03)vs(11.05±2.76)g,(2.70±0.54)vs(3.21±0.61),9.03±1.09 vs 11.52±1.23)(P＜0.05),while 40 mg/kg dosage of LiCl failed to improve some indexes(AMY,ascites,lung wet/dry weight ratio,pathological score)(P＞0.05).However,ALT level of LiCl-80 mg/kg group was higher than SAP group(312.47±69.41 vs 250.56±51.56 U/L)(P＜0.05),and there was no significant difference of Cr level between the two groups(79±17)vs(85±19)U/L(P＞0.05).ConclusionLiCl(60 mg/kg)administered intravenously was the optimal and effective dosage for attenuating the severity of severe acute pancreatitis.

Wistar rat;SevereAcute Pancreatitis;LiCl;Dose-response Relationship

R-332

A

1003—6350（2016）09—1380—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.002

2015-12-21)

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(編號2042015kf0086)

王衛(wèi)星。E-mail：sate.llite@163.com