趙衛(wèi)華 王燕紅 叢敏

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·綜 述·

TGF-β1/Smads信號通路在肝臟纖維化中的作用研究進展

趙衛(wèi)華 王燕紅 叢敏

肝臟纖維化是多種致病因素持續(xù)作用于肝臟，導(dǎo)致慢性肝臟損傷后的共同結(jié)果。主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)生成過多，降解相對不足，在肝臟內(nèi)大量沉積，導(dǎo)致肝臟纖維化，此病理過程是可逆的。目前認(rèn)為活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟纖維化發(fā)生時ECM的主要來源。肝臟中各種細(xì)胞生長因子、血管活性因子及脂肪因子均參與了肝臟纖維化的形成與進展，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是導(dǎo)致肝臟纖維化的最重要的細(xì)胞因子之一。本文將在已知的TGF-β1在肝臟纖維化中的作用基礎(chǔ)上，對近3～5年來有關(guān)調(diào)控因子對TGF-β1/Smads信號通路的影響及靶向TGF-β1信號通路的抗肝臟纖維化治療策略進行如下綜述。

一、TGF-β1概述

20世紀(jì)70年代初，在大鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)一種新的多肽被命名為肉瘤生長因子(SGF)，后來發(fā)現(xiàn)這個因子是由兩個不同功能的物質(zhì)組合而成，分別命名為轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。TGF-β 是由兩個結(jié)構(gòu)相似的二聚體借助分子間的二硫鍵連接而成。最新研究發(fā)現(xiàn)TGF-β有6種類型異構(gòu)體，而哺乳動物中則有TGF-β1、β2及β3三個亞型，其體外性質(zhì)類似，但體內(nèi)效應(yīng)不同[1]。

在生理狀態(tài)下，TGF-β1調(diào)節(jié)組織重建以及凋亡來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在肝臟纖維化發(fā)生時，TGF-β1是目前已知最強的促纖維化細(xì)胞因子之一，參與了肝臟纖維化的幾乎所有關(guān)鍵步驟。TGF-β1的促纖維化作用主要是通過TGF-β1/Smads信號途徑實現(xiàn)的[2]。

正常肝臟的實質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞并不表達(dá)TGF-β1。當(dāng)存在肝損傷時，骨髓來源的巨噬細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝細(xì)胞和血小板生成大量TGF-β1，TGF-β1促進HSC活化，而活化后的HSC自分泌TGF-β1也明顯增多。目前認(rèn)為骨髓來源的巨噬細(xì)胞與肝臟固有庫普弗細(xì)胞是TGF-β1的主要來源[3]。

二、肝臟纖維化中的TGF-β1/Smads信號通路及其調(diào)控因子

TGF-β1/Smads信號通路是TGF-β1發(fā)揮作用的最經(jīng)典及最常見途徑，在肝臟纖維化的啟動和肝星狀細(xì)胞的激活轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用。Smads蛋白是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心環(huán)節(jié)，是TGF-β1受體后信息分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌與凋亡。Smads蛋白是目前所知的最重要的TGF-β1受體胞內(nèi)激酶的底物。哺乳動物Smads蛋白家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同分為三類：(1)受體調(diào)節(jié)性Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8，能夠結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸受體，是TβRⅠ胞內(nèi)激酶的特異性底物，該組分子決定了配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性。(2)通用性Smad(Co-Smad)，只有一個成員Smad4，是不同TGF-β超家族成員信號傳遞必需的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它能夠與活化的R-Smad蛋白結(jié)合，并形成低聚體復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。(3)抑制性Smad(I-Smad)，包括Smad6、Smad7，它們可與活化的TβRⅠ牢固結(jié)合，抑制R-Smad分子與該受體的結(jié)合和磷酸化，從而對TGF-β超家族成員信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用，因而也稱拮抗型Smad[4]。

TGF-β1前體能夠與潛態(tài)TGF-β結(jié)合蛋白(LTBP)結(jié)合，當(dāng)受到活性氧(ROS)、纖溶酶及酸等各種因素影響時，TGF-β1才能從延遲活性肽(LAP)/LTBP復(fù)合體中釋放出來，發(fā)揮生物學(xué)效用，傳遞多種生物學(xué)信號[5]。TGF-β有Ⅰ型(TRⅠ)和Ⅱ型(TRⅡ)兩個重要的受體。成熟的TGF-β1在發(fā)揮作用時首先與TRⅡ結(jié)合，誘導(dǎo)其磷酸化再與TRI結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，然后該復(fù)合物可使調(diào)節(jié)受體的Smads蛋白(Smad2和Smad3)磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白與結(jié)合型Smads蛋白(Smad4)結(jié)合為Smads復(fù)合物并移位至肝細(xì)胞核，再與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，長度約18～22個核苷酸，通過與mRNA的3-UTRs端互補結(jié)合阻遏靶mRNA翻譯或者誘導(dǎo)其降解。研究表明miRNAs在細(xì)胞凋亡、增殖和分化等基本生命活動中起重要調(diào)控作用[7]。目前，在纖維化研究領(lǐng)域，miRNAs引起了人們的廣泛關(guān)注，miRNAs可通過TGF-β信號通路參與肝臟纖維化過程。

研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNAs是TGF-β信號通路的下游靶分子。比如，miR-33a有促纖維化作用，TGF-β可通過磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路誘導(dǎo)miR-33a的表達(dá)[8]。TGF-β還能通過Smad3信號通路促進miR-31表達(dá)，miR-31也是一種促纖維化因子，可以通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1抑制分子(FIH1)激活HSC[9]。TGF-β可以通過上調(diào)miR-199a抑制肝細(xì)胞生長因子(HGF)的表達(dá)，促進肝臟纖維化發(fā)生[10]。另一方面，TGF-β可以下調(diào)一些抗纖維化miRNA(如miR-150)在HSC中的表達(dá)，miR-150的抗纖維化作用與其同I型和IV型膠原蛋白基因直接結(jié)合的能力有關(guān)[11]。

Smad7是眾所周知的TGF-β/Smads信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。新的研究結(jié)果顯示，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)參與了大鼠肝臟纖維化及HSC活化過程，而且能夠抑制Smad7的表達(dá)。DNA甲基化抑制劑如5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-azadC)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化、增殖并降低促纖維化因子及膠原蛋白的表達(dá)，而且能夠解除TGF-β1對Smad7的抑制作用[12]。這為肝臟纖維化的治療提供了新的方向，值得深入研究。

Smad3被認(rèn)為是肝臟纖維化過程中TGF-β活化HSC主要的調(diào)節(jié)蛋白。近期研究證實Smad3和維生素D受體(VDR)之間的信號通路有相關(guān)性[13]。TGF-β信號通路通過核染色質(zhì)重構(gòu)來促進VDR與Smad3肝纖維化相關(guān)基因結(jié)合位點的競爭性結(jié)合。據(jù)此，VDR配體能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSC的活化，從而阻止肝臟纖維化的發(fā)生。

骨成形蛋白7(BMP-7)是一種多功能的細(xì)胞因子，屬于TGF-β超級家族的一個分支[14]，TGF-β和BMP-7有共同的下游Smad信號通路，但彼此相互抑制以保持各自生物學(xué)活性的穩(wěn)定。在哺乳動物中，TGF-β通過Smad2和Smad3的磷酸化傳遞細(xì)胞內(nèi)的信號。在肝臟纖維化過程中，TGF-β1激活Smad2/3，而BMP-7激活Smad1/5/8，然后磷酸化的Smad2/3和Smad1/5/8與Smad4形成異聚體，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)通過與DNA序列或輔酶因子相互作用來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。

另外，研究證實氧化應(yīng)激參與了TGF-β1 對HSC的活化，TGF-β1通過上調(diào)NADPH氧化酶4(NOX4)的表達(dá)來活化HSC[16]。同時，動物實驗也證實以NOX1、NOX4為靶標(biāo)的NADPH氧化酶(NOX)抑制劑可以改善肝臟纖維化[17]。

三、靶向TGF-β1信號通路的治療策略

TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為TGF-β1的典型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在肝臟纖維化中起到關(guān)鍵作用，如何通過干預(yù)TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路達(dá)到肝臟纖維化防治目的具有重要臨床價值。

TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Smad2/3特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β1信息，是TGF-β1促纖維化作用的胞內(nèi)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。調(diào)控Smad2/3蛋白可以阻斷TGF-β1信號的繼續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Park等[18]合成的TGF-β1 Ⅰ型受體激酶(ALK5)抑制劑EW7197，可以抑制TGF-β1/Smad2/3和ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Wang等[19]發(fā)現(xiàn)單用Smad7或尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)基因療法顯著抑制a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和TGF-β1的表達(dá)，而Smad7 和uPA聯(lián)合治療具有協(xié)同作用，療效更好。

另外，許多miRNA也可以直接或間接地調(diào)控TGF-β的表達(dá)、合成以及功能。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smurf2)是一個已知的TGF-β信號通路負(fù)調(diào)控因子，miR-424通過下調(diào)Smurf2表達(dá)從而增強TGF-β信號通路[20]。miR-454和miR-146a通過作用于smad4從而減弱TGF-β信號通路，抑制HSC活化[21]。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子11(KLF11)是一種TGF-β靶基因，其通過抑制Smad7的轉(zhuǎn)錄來增強TGF-β/Smad信號通路，抑制Smad7轉(zhuǎn)錄，miR-30通過靶向作用于KLF11間接上調(diào)Smad7，從而減弱TGF-β信號通路[22]。相反，miR-17-5p直接靶向作用于smad7，增強TGF-β信號通路，促進HSC活化，其抑制劑可顯著減少HSC中TGF-β介導(dǎo)的Col1a1和 a-SMA的表達(dá)[23]。此外，miR-200a靶向作用于TGF-β2和β-catenin ，導(dǎo)致a-SMA下調(diào)并抑制HSC增殖[24]。miR-21是在一個關(guān)于激活蛋白-1(AP-1)和程序性細(xì)胞凋亡因子4(PDCD4)的自動調(diào)節(jié)反饋回路研究中發(fā)現(xiàn)的，肝臟纖維化發(fā)生過程中該反饋回路能夠使miR-21在活化的HSC中保持高表達(dá)[25]。應(yīng)用3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-Diindolylmethane，DIM)干擾該反饋回路，直接作用于AP-1，抑制其活性，導(dǎo)致miR-21表達(dá)下調(diào)，TGF-β信號通路受抑制，肝臟纖維化程度得到改善[26]。

研究證實很多中藥制劑具有抗肝臟纖維化的作用，主要通過抑制TGF-β信號通路及HSC活化來發(fā)揮作用。例如傳統(tǒng)草藥槲寄生、黃芪芍藥痱子提取液(APE)等均能通過抑制Smad2信號及促進Smad7表達(dá)而起到抗肝臟纖維化的作用[27]。眾所周知的保肝中藥水飛薊素對CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化具有很好的保護作用，它在肝臟纖維化過程中的保護機制主要是干擾TGF-β的表達(dá)及抗氧化作用[28]。

最近一個新的防治肝臟纖維化的策略是通過自動免疫接種疫苗來抑制TGF-β信號通路，通過接種與載體蛋白交叉結(jié)合的TGF-β衍生多肽，使其在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗原性并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效價的自身抗體，這種方法能夠顯著抑制HSC中TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，有效防治CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化[29]。

四、總結(jié)與展望

TGF-β1這一內(nèi)源性信號分子在肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，以TGF-β1為靶標(biāo)的抗纖維化治療在未來臨床肝臟纖維化防治中具有重要意義。以TGF-β為靶標(biāo)的慢性肝臟纖維化動物模型的研究成果非常多，但目前仍未應(yīng)用于臨床。其中原因之一為TGF-β在疾病發(fā)展進程中的不同時段發(fā)揮了不同的作用。肝臟損傷的最初階段，TGF-β能夠增加肝臟的損傷，然后介導(dǎo)HSC的活化和創(chuàng)傷的修復(fù)；在肝細(xì)胞增殖與修復(fù)過程中，TGF-β又發(fā)揮了抑制細(xì)胞增殖的作用。在肝臟炎癥階段，TGF-β通過調(diào)控抑制性T細(xì)胞的表型來減輕炎癥，在慢性損傷和修復(fù)的過程中，TGF-β主要參與組織修復(fù)，是組織瘢痕形成的主要原因。在癌前期疾病階段，TGF-β作為細(xì)胞抑制劑可能避免肝癌的形成。在腫瘤的晚期階段，TGF-β的抗炎作用可以保護癌細(xì)胞免受機體的免疫攻擊[30]。因此以TGF-β為靶標(biāo)的慢性肝病的治療方法需要精確的時間點的評估及細(xì)胞類型的干預(yù)。其次干預(yù)選定的TGF-β下游信號通路分支或TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答需要進一步研究。在以后的研究中，我們需要明確在肝臟纖維化過程中TGF-β信號通路的復(fù)雜轉(zhuǎn)歸，以及TGF-β信號通路調(diào)控因子在TGF-β定向治療中發(fā)揮作用的更多細(xì)節(jié)以利于轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床病人。

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(本文編輯：張苗)

國家自然科學(xué)基金(81570542)，北京市自然科學(xué)基金(7142043)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才學(xué)科骨干資助項目(2013-3-057)

100050 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心 肝硬化轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室暨國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 通信作者：叢敏，Email:maomao0623@sina.com

2016-06-03)