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·綜述·

DNA甲基化在胃腸道間質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

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表觀遺傳學(xué)改變?nèi)鏒NA甲基化、基因組印記、染色體滅活等，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)作為消化系統(tǒng)較常見的腫瘤之一，表觀遺傳學(xué)改變特別是DNA甲基化也在GIST發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。此文回顧近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，綜述相關(guān)基因甲基化在GIST發(fā)病、預(yù)后評(píng)估、治療等方面的研究進(jìn)展。

胃腸道間質(zhì)瘤；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化

胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，c-kit或PDGFRA基因發(fā)生功能獲得性突變是其發(fā)病的始動(dòng)因素，其中前者占80%以上[1-2]。GIST的常規(guī)治療手段是手術(shù)或內(nèi)鏡切除，但存在一定的局限性[3]。即使病灶完全切除，患者的5年生存率也僅為32%～78%，高危組的術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)85%～90%[4]，這可能與c-kit基因發(fā)生二次突變有關(guān)[5]。因此，需聯(lián)合分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)如伊馬替尼(imatinib)治療[6-7]。有研究顯示，伊馬替尼可延緩75%～90%患者的疾病進(jìn)展，5%患者可完全緩解[8]。近年Joensuu等[9]也肯定了放射治療聯(lián)合靶向藥物在GIST治療中的價(jià)值。但部分患者會(huì)發(fā)生繼發(fā)性耐藥，且野生型[10]及PDGFRA D842、D846V突變型[11]對(duì)伊馬替尼并不敏感。因此亟需其他方法來克服當(dāng)前的問題，鑒于表觀遺傳學(xué)改變?nèi)鏒NA甲基化在GIST發(fā)病過程中的重要作用而越來越受到重視，本文回顧相關(guān)文獻(xiàn)就此研究進(jìn)展作一綜述。

1　DNA甲基化的作用機(jī)制

DNA甲基化是最常見的基因修飾方式之一，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)及去甲基酶協(xié)同完成。DNA甲基化的位點(diǎn)常在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，在DNMT的作用下選擇性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶[12]。DNMT有5種，分別為DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L，其中DNMT1可使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化，并起到維持甲基化的作用，DNMT3A和DNMT3B則是從頭開始甲基化酶。DNA異常甲基化被公認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，通常發(fā)生于基因啟動(dòng)子的CpG島，引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象和穩(wěn)定性以及與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，引起基因沉默[13]。有研究顯示，啟動(dòng)子高甲基化所導(dǎo)致的抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一[14]。

2　GIST中的DNA甲基化

2003年House等[15]應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)對(duì)38例發(fā)生c-kit基因突變的GIST標(biāo)本進(jìn)行了11個(gè)抑癌基因(p16/INK4a、APC、MGMT、hMLH1、p73、E-cadherin、RAR-b、RASSF1A、RB、ER、DAPK)的甲基化程度檢測(cè)，結(jié)果顯示84%的樣本存在異常甲基化，其中最常見的基因?yàn)镸GMT(47%)、p16(45%)、RASSF1A(40%)、E-cadherin(37%)、hMLH1(34%)及APC(31%)。Okamoto等[16]對(duì)115例GIST標(biāo)本進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)4個(gè)抑癌基因(RASSF1A、P16/INK4A、E-cadherin、MGMT)存在異常甲基化，且甲基化程度隨著惡性程度增加而逐漸增加，證實(shí)了DNA異常甲基化在GIST中的存在并提示相關(guān)基因甲基化水平可能與GIST惡性程度相關(guān)。

2008年Lasota等[17]發(fā)現(xiàn)了一種不存在c-kit基因或PDGFRA基因突變的野生型GIST，以琥珀酸脫氫酶(SDH)缺陷為主要表現(xiàn)[18-19]。SDH復(fù)合物位于線粒體膜內(nèi)層，在電子傳遞鏈及檸檬酸循環(huán)中起作用，由SDHA、SDHB、SDHC、SDHD四個(gè)亞單位組成。SDHA是催化單位，負(fù)責(zé)將琥珀酸轉(zhuǎn)變?yōu)檠雍魉?，SDHB是一種鐵硫蛋白，負(fù)責(zé)電子傳遞，SDHC及SDHD是膜錨定單位[20]。SDH缺陷可有不同的臨床表現(xiàn)，如Carney三聯(lián)征(支氣管軟骨瘤、多發(fā)性胃平滑肌肉瘤、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)、Carney-Stratakis綜合征(家族性GIST、副神經(jīng)節(jié)瘤)等。該型GIST局限在胃，而腸內(nèi)罕見。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是較特征性的表現(xiàn)，但只發(fā)生在少數(shù)患者中[21]。Haller等[22]發(fā)現(xiàn)GIST合并Carney三聯(lián)征的患者的SDHC甲基化程度明顯偏高，推測(cè)可能與SDHC的異常甲基化有關(guān)。目前認(rèn)為該型GIST可能的發(fā)病機(jī)制包括：(1)SDH亞單位突變可能改變線粒體凋亡通路，增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA損傷、基因不穩(wěn)定及腫瘤形成；(2)SDH缺陷導(dǎo)致琥珀酸積累，后者是α-酮戊二酸的類似物，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶及TET家族，TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，后者是DNA脫甲基化所需，從而使DNA甲基化水平和基因表達(dá)發(fā)生改變[19,23]。

DNA低甲基化可引起染色體不穩(wěn)定、原癌基因激活等，可能也在GIST中起著重要作用。Igarashi等[1]發(fā)現(xiàn)致癌基因LINE-1在惡性GIST中的甲基化程度較良性GIST顯著降低，且與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)LINE-1基因低甲基化可能在誘導(dǎo)染色體畸變并增加GIST侵襲性方面起著重要的作用。Okamoto等[16]也持相同觀點(diǎn)。近年來Haller等[24]用亞硫酸鹽測(cè)序法對(duì)76例冰凍標(biāo)本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示致癌基因SPP1啟動(dòng)子甲基化程度與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，并且應(yīng)用脫甲基劑可引起劑量依賴的SPP1基因甲基化下調(diào)。SPP1是趨化因子樣糖蛋白，分泌進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)后與CD44及整合素受體結(jié)合，激活PI3K/AKT、RAS/MAPK等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，通過促進(jìn)增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成影響致癌潛能[25]，而PI3K/AKT、RAS/MAPK正是GIST中主要的信號(hào)通路[26]。

伊馬替尼是治療進(jìn)展期GIST的有效藥物，但長期用藥易導(dǎo)致耐藥性且停藥后復(fù)發(fā)率較高。Yang等[27]的研究顯示，長期應(yīng)用伊馬替尼治療后，抑癌基因PTEN甲基化程度明顯升高，而其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以抑制PI3K/Akt通路[28]，推測(cè)長期應(yīng)用TKI導(dǎo)致PTEN基因甲基化，繼而引起的PI3K/Akt/mTOR通路激活可能是GIST對(duì)TKI產(chǎn)生耐藥的原因。

3　DNA甲基化在GIST中的應(yīng)用

3.1DNA甲基化在判斷疾病預(yù)后中的作用

不少文獻(xiàn)報(bào)道DNA甲基化可作為判斷GIST預(yù)后的指標(biāo)。House等[15]發(fā)現(xiàn)抑癌基因E-cadherin發(fā)生甲基化的患者的5年生存率(19%)明顯低于非甲基化者(71%)，推測(cè)該基因甲基化是提示GIST預(yù)后較差的指標(biāo)之一，若伴有hMLH1基因甲基化缺失，則腫瘤易早期復(fù)發(fā)。Okamoto等[16]對(duì)115例GIST標(biāo)本進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，RASSF1A基因的甲基化程度隨惡性程度增加而逐漸增加，p16基因甲基化特異性地出現(xiàn)在惡性GIST中，推測(cè)RASSF1A基因甲基化是腫瘤形成的早期事件且與進(jìn)展相關(guān)，p16基因甲基化是進(jìn)展期GIST的特殊事件，可用于疾病分期。此外，甲基化CpG島擴(kuò)增與芯片組合分析(MCAM)顯示REC8、PAX3、p16等基因發(fā)生甲基化者預(yù)后顯著變差。國內(nèi)梁建芳等[29]也得出了類似的結(jié)論。張立東等[30]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了54例GIST標(biāo)本及40例正常胃腸斷端組織中maspin基因甲基化和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨著GIST侵襲性的增加，maspin基因甲基化程度顯著增加，其蛋白表達(dá)顯著降低，推測(cè)maspin基因甲基化程度與GIST浸潤進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可用于評(píng)估GIST生物學(xué)行為。此外，前文提到的LINE-1、SPP1等基因甲基化程度降低與GIST侵襲性呈正相關(guān)，均可作為評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)。

3.2DNA甲基化在疾病治療中的作用

鑒于DNA甲基化在GIST發(fā)病過程中的重要作用，不少專家提出將其作為治療靶點(diǎn)，通過逆轉(zhuǎn)甲基化來治療GIST。DNMT是甲基化的關(guān)鍵酶，其表達(dá)及活性在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)存在改變[31]。Subramaniam等[32]發(fā)現(xiàn)抑制DNMT可增加抑癌基因表達(dá)而減少腫瘤發(fā)生。Lin等[33]也認(rèn)為一些可以使DNMT失活的蛋白如MDM2、AKT及CDK的抑制劑可能是治療腫瘤的新方法。目前已有2種藥物(阿扎胞苷和地西他濱)通過抑制DNMT產(chǎn)生脫甲基化作用而使靶基因重新表達(dá)，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療骨髓異常增生綜合征，但在GIST中的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步證實(shí)[34]。

4　問題和展望

目前有關(guān)DNA甲基化仍有許多問題尚待解決，如DNA甲基化如何與其他表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)工作？這些網(wǎng)絡(luò)在GIST或其他疾病中發(fā)揮了什么作用？哪些能用于預(yù)防、診斷和治療[35]？一些結(jié)論仍有爭(zhēng)議，如House等[15]認(rèn)為E-cadherin甲基化與GIST的惡性組織學(xué)特征相關(guān)，但Saito等[36]則持相反意見。隨著研究的不斷深入，不同基因在GIST中的甲基化程度及其在評(píng)估危險(xiǎn)度、預(yù)后等方面的作用也將被不斷豐富和完善。相信在不久的將來會(huì)有一張完整的DNA甲基化譜，為GIST的診斷、治療等翻開新的篇章。

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(本文編輯：林磊)

310003杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

季峰，Email: jifeng1126@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.011

2016-01-30)