馬志恒　蔣海存　陳建新　郝　鑫　李　萍　賈超麗　董　冬　張　剛

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·臨床研究·

mTOR信號(hào)通路與胃癌的相關(guān)性研究

馬志恒蔣海存陳建新郝鑫李萍賈超麗董冬張剛

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，其自酵母中分離出來(lái)，在P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路中是蛋白激酶B(Akt)的下游底物。mTOR是一種含有2 549個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子，生理狀態(tài)下，該蛋白在各種刺激因子的作用下發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等作用，因此mTOR在多種腫瘤組織中表達(dá)異常受到關(guān)注，也是腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。p-mTOR是磷酸化的mTOR，是mTOR的活化形式。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western-blot)技術(shù)來(lái)檢測(cè)胃癌及正常胃黏膜組織中p-mTOR mRNA及蛋白的表達(dá)情況，為胃癌的臨床診斷和治療提供幫助。

1　材料和方法

1.1材料

收集河北大學(xué)附屬醫(yī)院2011年1月至2015年1月期間手術(shù)切除的新鮮胃癌標(biāo)本50例，癌旁正常胃黏膜組織50例(距腫瘤邊緣>5 cm)，術(shù)前均未行放射治療及化學(xué)治療，術(shù)后病理學(xué)檢查均為胃腺癌。50例胃癌標(biāo)本中，男31例，女19例；年齡42～82歲，平均年齡(53±4.51)歲，年齡≤50歲27例，年齡>50歲23例；高分化10例，中低分化40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；浸潤(rùn)胃全層37例，未累及胃全層13例。新鮮標(biāo)本-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

兔抗人p-mTOR單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PCR引物合成于大連Takara公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。β-actin一抗為鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3RT-PCR方法檢測(cè)p-mTOR mRNA的表達(dá)

液氮中取出少量胃組織標(biāo)本，用眼科剪剪碎，用TRIzol、氯仿和異丙醇提取總RNA，分析其完整性、純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL。6 μL的DNA Ladder及20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，45 min)，相應(yīng)位點(diǎn)出現(xiàn)單一電泳條帶為陽(yáng)性表達(dá)。采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，以β-actin做內(nèi)參照，采用Quantity one4.62軟件統(tǒng)計(jì)各條帶的積分光密度值，以積分光密度值比值來(lái)分析各組之間的差異。p-mTOR上游引物為5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′，下游引物為5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′，β-actin上游引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.4Western-blot方法檢測(cè)p-mTOR蛋白的表達(dá)

液氮中取出少量胃組織標(biāo)本，用眼科剪剪碎，提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，濃縮膠5%，分離膠12%，加樣，每孔上樣量為20 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶粉封閉液中封閉；加入一抗兔抗人p-mTOR單克隆抗體和小鼠抗人β-actin單克隆抗體，PBS洗膜3次，每次15 min；加二抗于室溫孵育2 h后曝光，觀察結(jié)果。p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量用p-mTOR/β-actin表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1p-mTOR mRNA及蛋白在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)

p-mTOR mRNA擴(kuò)增片段大小為190 bp，內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段大小為250 bp。RT-PCR檢測(cè)胃癌及正常胃黏膜組織中p-mTOR mRNA及蛋白的表達(dá)水平。50例胃癌標(biāo)本中，p-mTOR mRNA的相對(duì)定量值為(0.626±0.041)，顯著高于正常胃黏膜組織中p-mTOR mRNA的表達(dá)(0.318±0.091)。Western-blot方法的檢測(cè)結(jié)果顯示，50例胃癌標(biāo)本中，p-mTOR蛋白的相對(duì)定量值為(0.543±0.052)，正常胃黏膜組織中的相對(duì)表達(dá)量為(0.295±0.021)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1、圖2。

2.2p-mTOR mRNA及蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，p-mTOR蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05)，腫瘤分化程度的越低則p-mTOR蛋白的表達(dá)越高。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，p-mTOR mRNA的表達(dá)與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05)。兩種方法的結(jié)果一致。見(jiàn)表2。

表1　p-mTOR mRNA及蛋白在胃癌及正常胃黏膜中的表達(dá)

圖 1　p-mTOR mRNA在胃癌及正常胃黏膜中的表達(dá)

圖 2　p-mTOR蛋白在胃癌及正常胃黏膜中的表達(dá)

臨床特征np-mTOR蛋白表達(dá)量tPp-mTORmRNA表達(dá)量tP年齡/歲≤50>5027230.583±0.0280.529±0.0333.6310.8200.641±0.0250.618±0.0271.5300.363性別男女31190.552±0.0540.539±0.0811.8700.1800641±0.0280.620±0.0100.2310.418分化程度高中/低10400.243±0.0230.927±0.0373.4810.0200.491±0.0510.793±0.0633.8410.049淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)有15350.518±0.0220.593±0.0481.5310.0900.585±0.0200.695±0.0173.6130.070浸潤(rùn)深度 浸潤(rùn)全層 未達(dá)全層37130.601±0.0200.498±0.0273.3210.0600.702±0.0260.579±0.0762.1600.059

2.3p-mTOR mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析顯示，p-mTOR mRNA與蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.518，P=0.000)。

3　討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是公認(rèn)的腫瘤病因之一，因此成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。mTOR為多條信號(hào)通路的重要的下游分子，因其在不同物種(從酵母類(lèi)到各種高級(jí)哺乳動(dòng)物)中固定存在，推斷其有一定的生理作用。正常生理狀態(tài)下，mTOR調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的分裂增殖，當(dāng)正常細(xì)胞異常增生甚至發(fā)生癌變時(shí)，mTOR通過(guò)活化過(guò)度表達(dá)而發(fā)揮作用，主要表現(xiàn)為參與癌細(xì)胞的代謝、凋亡、生長(zhǎng)、增殖、分化等。mTOR參與的信號(hào)通路主要有兩條：PI3K/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/mTOR信號(hào)通路[1]。PI3K/Akt/mTOR通路在細(xì)胞增殖及腫瘤血管形成中發(fā)揮重要的作用，在腫瘤的病因?qū)W與預(yù)后因素中的研究較多，其在腫瘤形成過(guò)程中的作用包括促癌基因受體的活化、PI3K基因的突變或擴(kuò)增、抑癌基因PTEN的表達(dá)減少、Akt基因的突變或擴(kuò)增等。另一條是LKB1/AMPK/mTOR信號(hào)通路，抑癌基因LKB1通過(guò)磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)從而激活A(yù)MPK，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)mTOR的負(fù)性調(diào)控[2-4]。

mTOR與腫瘤發(fā)生的關(guān)系在不同組織學(xué)類(lèi)型中均有研究。韓麗紅等[5]采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)消化道腫瘤及健康體檢者血清中mTOR的含量，結(jié)果顯示消化道腫瘤患者血清中mTOR的含量顯著高于健康體檢者，提示mTOR可能可以作為消化道腫瘤診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的新指標(biāo)。劉椏菲等[6]采用半定量免疫組化法檢測(cè)35例低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤、36例高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤及10例正常腦組織中mTOR的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常腦組織相比，人腦膠質(zhì)瘤中的mTOR表達(dá)均顯著增加；在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中，兩者的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低級(jí)別組；認(rèn)為mTOR在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯增加，其可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。其他腫瘤如垂體瘤[7]、胃癌[8]、宮頸癌[9]和肺癌[10]等也均見(jiàn)有mTOR過(guò)表達(dá)的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，50例胃癌標(biāo)本中p-mTOR mRNA及蛋白的相對(duì)定量值顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致。RT-PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果均顯示，p-mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，而與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05)，隨著胃癌組織惡性程度的增加，p-mTOR的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，這也充分說(shuō)明了該基因與胃癌發(fā)生存在密切的關(guān)系。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤組織(包括胃癌)中發(fā)揮著重要的作用，胃癌的發(fā)展是多基因、多種信號(hào)通路共同作用的過(guò)程，本研究為胃癌的研究打下了良好的基礎(chǔ)，也為胃癌的分子學(xué)治療提供了一定的依據(jù)。

1 陸建國(guó). mTOR信號(hào)通路與腫瘤研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2015, 31: 199-202.

2 Pisick E, Jagadeesh S, Salgia R. Receptor tyrosine kinases and inhibitors in lung cancer[J]. Sci World J, 2004, 6: 589-604.

3 Shaw RJ, Cantley LC. Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth[J]. Nature, 2006, 441: 424-430.

4 Massion PP, Taflan PM, Shyr Y, et al. Early involvement of the phos-phatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in lung cancer progression[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2004, 170: 1088-1094.

5 韓麗紅, 閆斌, 秦艷晶. 血清mTOR檢測(cè)對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者的臨床意義[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備, 2014, 17: 17-18.

6 劉椏菲, 劉獻(xiàn)志, 翟廣. mTOR和Survivin在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究, 2015, 24 : 4-6.

7 Monsalves E, Jurasczhka K, Tateno T, et al. The PI3K/AKT/mTOR pathway in the pathophysiology and treatment of pituitary adenomas[J]. Endocr Relat Cancer, 2014, 21: R331-R344.

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9 夏百榮, 孟凡玲, 盧北燕. mTOR, eIF4E, 4E-BP1在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志, 2011, 25: 301-305.

10 王亮, 許紹發(fā), 岳文濤, 等. mTOR和PTEN在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國(guó)肺癌雜志, 2010, 13: 717-721.

(本文編輯：林磊)

河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究計(jì)劃項(xiàng)目(361007)

071500河北保定，高陽(yáng)縣醫(yī)院外科(馬志恒，蔣海存，陳建新)；071000河北保定，河北大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科(李萍，賈超麗，董冬，張剛，郝鑫)

張剛，Email: zhanggang268@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.019

2016-01-11)