秦智娟，楊曉清，張玉泉

·綜述·

基因敲除在雌性小鼠生殖系統(tǒng)研究中的應(yīng)用

秦智娟，楊曉清，張玉泉△

【摘要】基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組技術(shù)發(fā)展起來的，在對基因功能、發(fā)育生物學(xué)和疾病的研究中發(fā)揮了重要作用。直到現(xiàn)在，運用同源重組實現(xiàn)基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍最經(jīng)典的方法?；蚯贸齽游锬Ｐ椭袘?yīng)用最廣泛的是基因敲除小鼠模型。綜述目前國內(nèi)外實現(xiàn)基因敲除的幾種重要方法以及利用同源重組實現(xiàn)的基因敲除技術(shù)在雌性小鼠生殖系統(tǒng)研究中的應(yīng)用。這些應(yīng)用主要包括研究性激素對生殖器官及激素依賴性疾病的影響、細(xì)胞分泌因子在發(fā)育期調(diào)控生殖器官組織的機制及胚胎形成后的性腺發(fā)育與成熟缺陷等。

【關(guān)鍵詞】小鼠,基因敲除；泌尿生殖系統(tǒng)；DNA，重組；誘變，插入；RNA干擾

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：51-55）

科學(xué)家們運用分子生物學(xué)方法改變動物體內(nèi)某一特定基因制成基因敲除的動物模型，可以為人類探究疾病發(fā)病的分子機制、病理特征及診療方法等提供良好的實驗?zāi)Ｐ??；蚯贸慕⑿枰朔鞣N技術(shù)困難，如DNA的分離、質(zhì)粒構(gòu)建及同源重組效率等。過去比較熟悉的基因敲除方法有3種：同源重組法、插入突變法、RNA干擾（RNA interference，RNAi）法。近些年來一些創(chuàng)新性的基因敲除技術(shù)也備受國際關(guān)注，如鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）基因打靶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator -like effector nucleases，TALENs）基因敲除以及一種全新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 [clusteredregularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated 9]。雖然基因敲除的方法多種，且近兩年CRISPR/Cas9技術(shù)已被國外不少科學(xué)家視為未來承擔(dān)細(xì)胞基因研究重任的領(lǐng)頭羊，但目前為止用于研究基因生物學(xué)功能的小鼠基因敲除模型仍大多依賴同源重組法。

1　基因敲除方法

1.1同源重組法同源重組又叫基因打靶技術(shù)，是目前基因敲除技術(shù)中的金標(biāo)準(zhǔn)。同源重組法是以打靶載體質(zhì)粒和胚胎干細(xì)胞（簡稱ES細(xì)胞）技術(shù)為基礎(chǔ)，通過DNA同源重組使特定基因失活。基因敲除載體是根據(jù)需敲除基因序列的特點設(shè)計的含有2個篩選標(biāo)記基因和特定基因同源臂序列的克隆載體，載體的構(gòu)建是基因打靶技術(shù)的核心。將該載體通過電穿孔法或顯微注射法導(dǎo)入同源的ES細(xì)胞中，使敲除載體與ES細(xì)胞核基因組定點發(fā)生同源重組，將載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá)。大多以新霉素（Neo）抗性基因作為陽性篩選標(biāo)記基因，陰性篩選標(biāo)記基因目前最常用的是白喉毒素A亞基（Diphtheria Toxin Subinit A，DTA），DTA位于同源序列之外不參與同源重組[1]。在隨機插入的情況下，如果有DTA表達(dá)，DTA能夠直接殺死ES細(xì)胞，保證只有發(fā)生同源重組的ES細(xì)胞才能在含G418的培養(yǎng)基中存活。將正負(fù)篩選發(fā)生同源重組的陽性克隆細(xì)胞體外擴增，通過囊胚顯微注射法獲得嵌合體胚胎。再將此嵌合體胚胎植入假孕小鼠子宮內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合鼠，嵌合鼠與正常小鼠交配得到的后代再進(jìn)行篩選。

基因敲除技術(shù)又可以分為完全基因敲除和條件型基因敲除。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性，條件型基因敲除則通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除，主要應(yīng)用于胚胎致死基因的研究。源自噬菌體P1的Cre/Loxp和來自酵母的FLp/Frt系統(tǒng)是條件型基因敲除的關(guān)鍵[2]。將被同向Loxp序列標(biāo)記的陽性鼠與特定組織的重組酶Cre工具鼠交配，重組酶Cre根據(jù)各啟動子的時空特異性可在特定發(fā)育階段或特定組織細(xì)胞中將兩個同向Loxp位點之間的DNA片段敲除，從而實現(xiàn)對目的基因不同位置或不同程度的修飾。這一方法使研究某個基因在特定組織器官中的生理學(xué)功能成為可能。

1.2插入突變法插入突變是指利用某些能隨機插入DNA序列的病毒、細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞的基因組中進(jìn)行隨機插入，誘發(fā)目的基因發(fā)生突變[3]。隨機插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變，兩者都是在植物中廣泛應(yīng)用的基因敲除手段，在動物模型構(gòu)建中運用較少。

1.3RNAi法RNAi是通過雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄水平后的特定基因沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可產(chǎn)生一系列特定長度的小干擾RNA （siRNA），siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，這種復(fù)合物以三磷酸腺苷（ATP）依賴的方式催化雙鏈siRNA解旋，單鏈siRNA通過堿基配對識別與之互補的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，從而導(dǎo)致靶基因的沉默。RNAi廣泛存在于真菌、植物和動物中，可抑制單個基因、基因家族甚至整個基因組的基因表達(dá)，具有特異性強、效率高、穿透性強等優(yōu)點[4]。但RNAi也有其局限性，其不能應(yīng)用于所有的基因和細(xì)胞類型，且存在位置效應(yīng)和不完全敲除等弊端，因此不能替代傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)。

1.4ZFN基因打靶技術(shù)ZFN是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。其中DNA識別域賦予特異性，在DNA特定位點結(jié)合，而非特異性核酸內(nèi)切酶具備剪切功能，兩者結(jié)合就可在DNA特定位點進(jìn)行定點斷裂。DNA識別域由一系列Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶，只在二聚體狀態(tài)時才有酶切活性，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個ZFN，識別特定的位點，當(dāng)兩個識別位點相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時，兩個單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能，從而達(dá)到DNA定點剪切的目的[5]。ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，可以精確地修飾基因或其周圍的調(diào)控元件，通過原核注射或胞質(zhì)注射得到基因敲除動物，為研究人類疾病構(gòu)建良好的動物模型。

1.5TALENs基因敲除轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶是第二種人工核酸酶，TALENs與ZFNs有相似之處，其構(gòu)建是基于植物病原體黃單胞菌分泌的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子TALE可以識別DNA序列的原理[6]。TALE蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核苷酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系，由34個氨基酸重復(fù)序列組成一個單元，34個氨基酸中的第12和13個氨基酸對應(yīng)識別1個目標(biāo)堿基。TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性干擾目標(biāo)基因，TALE蛋白中的DNA結(jié)合域與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域融合，在特異位點切斷目的基因序列。TALENs解決了ZENs方法不能識別某些目標(biāo)基因序列及識別序列易受上下游序列影響等問題，無基因序列、細(xì)胞、物種的限制，使基因操作變得更加簡便，但目前該技術(shù)難度較大，敲除效率也有待提高。

1.6CRISPR/Cas9基因敲除2013年初，由于第3種人工核酸內(nèi)切酶Cas9的出現(xiàn)，一種創(chuàng)新性的由RNA介導(dǎo)Cas核酸酶對靶基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)正日益成熟[7]。CRISPR是在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的成簇的、有規(guī)律的、間隔的短回文重復(fù)序列。2007年，Barrangou等[8]首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可能利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini 等[9]又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)可阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，其是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR衍生出的RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）通過堿基配對與反式激活RNA（trans-activating RNA，tracrRNA）結(jié)合形成特定的復(fù)合物，該復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點處切割雙鏈DNA。通過人工設(shè)計這兩種RNA，可改造形成具有引導(dǎo)作用的RNA（guide RNA），引導(dǎo)Cas9對DNA實行定點切割。作為一種RNA引導(dǎo)的dsDNA結(jié)合蛋白，Cas9核酸酶能夠共定位RNA、DNA和蛋白。CRISPR/ Cas9可以同時在同一ES細(xì)胞中的多個位點實現(xiàn)多靶點同時酶切，使多個基因敲除成為可能[10]，目前使CRISPR/Cas9技術(shù)受限的主要原因是其具有嚴(yán)重的脫靶性。該技術(shù)的產(chǎn)生預(yù)示著在未來幾年內(nèi)，動植物發(fā)育、干細(xì)胞定向分化、遺傳疾病定點修復(fù)等都將得到迅猛的發(fā)展。

2　基因敲除模型在雌性小鼠生殖系統(tǒng)研究中的應(yīng)用

2.1生殖相關(guān)激素及其受體敲除同源重組法的載體構(gòu)建及驗證步驟[以卵泡刺激素β（FSHβ）為例]：從特定的細(xì)菌人工染色體中分離出FSHβ基因并進(jìn)行克隆，通過基因測序證實為FSHβ基因。根據(jù)FSHβ基因序列的特點，敲除外顯子1和外顯子2以及大部分的外顯子3約2.3 kb的區(qū)域。然后構(gòu)建一個打靶載體，包括分別與FSHβ基因5′端和3′端的部分區(qū)域同源的基因組序列，正選擇標(biāo)記基因（如新霉素耐藥基因）插入目的基因片段中，負(fù)選擇標(biāo)記基因（如單純皰疹病毒胸苷激酶、DTA等）連接于載體末端。在線性化位點將載體線性化后，將其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組和克隆篩選[11]。最終可通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及DNA印跡（Southern blot）實驗證實干擾片段導(dǎo)入成功。

2.1.1FSH和黃體生成激素（LH）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH完全敲除的雌性小鼠由于卵泡在腔前期就已停止發(fā)育而不具備生育功能，子宮變得細(xì)小，組織學(xué)檢查呈萎縮狀態(tài)[12]。FSH參與調(diào)節(jié)細(xì)胞色素P450 19組A組多肽1芳香化酶（Cyp19a1），該酶主要參與卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素的過程；PCR實驗發(fā)現(xiàn)FSH敲除鼠Cyp19a1的表達(dá)受抑制，雌激素表達(dá)明顯下降。FSH敲除鼠在生殖系統(tǒng)的諸多缺陷是顯而易見的，現(xiàn)在不少研究者正利用轉(zhuǎn)基因動物模型構(gòu)建FSHβ過表達(dá)小鼠來修復(fù)FSH敲除鼠在生殖系統(tǒng)中表現(xiàn)出來的各種缺陷[13]，從正反面驗證FSH在生殖系統(tǒng)中的重要作用。LH敲除的雌鼠性腺機能減退也不具有生育能力，組織學(xué)檢查顯示LH敲除鼠含有退化的卵母細(xì)胞的基礎(chǔ)卵泡發(fā)育異常，部分初級卵泡和次級卵泡形成正常，排卵期前卵泡及黃體形成受損，雌孕激素的表達(dá)均明顯下降，子宮內(nèi)膜變薄，子宮發(fā)育明顯不良。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠的發(fā)情周期紊亂[14]。由此可見，F(xiàn)SH和LH在卵泡形成時有其各自特定的功能，不可替代，它們對于生殖系統(tǒng)的形成和發(fā)育均至關(guān)重要，缺一不可。

2.1.2雌激素受體（ER）ER包括ERα和ERβ，主要在生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織中高表達(dá)。ERα敲除雌鼠子宮內(nèi)膜形成較薄，卵巢未見黃體，生育能力缺失，免疫組化結(jié)果顯示泌乳素（PRL）減少，而LH 和FSH細(xì)胞表達(dá)增加[12]。行為學(xué)觀察表明ERβ敲除小鼠性行為正常，雌鼠生育功能受損，但仍有生育可能；與野生小鼠相比，ERβ基因敲除小鼠的子宮在組織學(xué)方面未見異常。ERα和ERβ基因共敲除的小鼠不孕，生殖道發(fā)育無異常，雌鼠出生后卵巢發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，卵泡分化轉(zhuǎn)變成類似睪丸的輸精管結(jié)構(gòu)[13]。間接表明ER對于保持卵巢中干細(xì)胞和體細(xì)胞的活性不可或缺，在維持動物性腺的正常功能中發(fā)揮著重要作用。

2.1.3孕激素受體（PR）PR是一種核受體因子，在排卵過程中至關(guān)重要。分為2種亞型：PR-A和PR-B，兩者在介導(dǎo)與調(diào)節(jié)卵巢、子宮和乳腺的功能及生殖活動中起關(guān)鍵作用。將這2種受體基因共敲除可導(dǎo)致整個生殖系統(tǒng)出現(xiàn)病變[15]。PR敲除的雌性小鼠組織學(xué)檢查顯示卵泡發(fā)育不良、子宮內(nèi)膜炎癥、子宮畸形、乳腺發(fā)育受阻，與野生型鼠相比，LH和PRL表達(dá)增加。還有研究顯示，PR基因敲除鼠中降解和伴血栓形成樣金屬蛋白酶-1和組織蛋白酶L表達(dá)異常[16]，這兩種蛋白酶可與PR結(jié)合，在卵泡破裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.1.4垂體PRL垂體PRL及其受體是哺乳動物生殖系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。PRL敲除的雌鼠表現(xiàn)為多方面的生殖缺陷，如不孕，不規(guī)則的發(fā)情周期，血LH 及FSH表達(dá)降低。同F(xiàn)SH一樣，也有學(xué)者利用高泌乳素（hyper-prolactinemia，hPRL）轉(zhuǎn)基因鼠來提高PRL敲除鼠體內(nèi)的PRL水平，觀察敲除鼠的生殖系統(tǒng)是否得到修復(fù)，結(jié)果顯示PRL基因敲除鼠與hPRL轉(zhuǎn)基因鼠交配后可正常生育[17]。PRL受體敲除鼠懷孕后，黃體不能產(chǎn)生孕激素維持妊娠，使胚胎著床失敗，但注入外源性孕激素后胚胎著床和胚胎發(fā)育均可恢復(fù)正常。

2.1.5催產(chǎn)素（OXT）OXT可刺激乳腺導(dǎo)管肌上皮細(xì)胞收縮，促進(jìn)乳汁分泌和子宮收縮，調(diào)節(jié)子宮前列腺素的釋放及黃體的功能。OXT基因敲除鼠仍具有生育能力，性行為和母性行為正常，但失去泌乳能力，社會行為異常，表現(xiàn)為抑郁傾向[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)，正常的雌鼠可通過識別特殊氣味來選擇沒有寄生蟲感染的雄鼠進(jìn)行交配，從而減少寄生蟲的傳播，而OXT敲除鼠識別能力受損，嗅覺和學(xué)習(xí)功能均正常，具體相關(guān)機制仍不清楚[19]。OXT敲除的雌鼠分娩后無乳汁分泌，而靜脈注入OXT后泌乳行為正常，暗示OXT可能通過某一機制刺激PRL分泌增加[20]。野生型及OXT敲除鼠持續(xù)注入OXT的研究表明，低濃度OXT使分娩延遲，同時血孕激素濃度下降也延遲；而高濃度OTX利于分娩。

2.2其他生殖相關(guān)因子的敲除

2.2.1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）LIF可調(diào)節(jié)著床必需的限速酶，LIF缺失的小鼠胚泡著床周圍的子宮內(nèi)膜中血管內(nèi)皮生長因子及環(huán)氧合酶2（COX-2）表達(dá)紊亂導(dǎo)致著床失敗，而表達(dá)LIF的小鼠子宮內(nèi)膜可能通過釋放信號，調(diào)節(jié)相關(guān)因子、激素以及酶的釋放來促進(jìn)著床。LIF敲除實驗已證實，LIF是小鼠胚胎著床的必要因子[21]。LIF純合子敲除雌鼠分別與LIF純合子敲除雄鼠及野生雄鼠交配后均有受精卵形成并可發(fā)育至正常胚泡階段，但不能著床。而將這兩種胚泡移植入正常雌鼠的宮腔內(nèi)均可妊娠并繼續(xù)發(fā)育。表明LIF對胚胎發(fā)育不是絕對必需的，不過LIF缺陷胚胎的質(zhì)量和體積均比雜合胚胎小，提示LIF可能作為胚胎營養(yǎng)因子促進(jìn)胚胎發(fā)育[22]。說明LIF基因突變也可能是不明原因不孕及體外受精-胚胎移植后著床失敗的重要原因之一。

2.2.2SMAD蛋白SMAD是近幾年發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，該家族成員眾多。SMAD3的敲除使卵泡增長變緩，特點是卵泡直徑小、低增殖細(xì)胞核抗原水平及低細(xì)胞周期基因的表達(dá)。此外，SMAD3敲除雌鼠卵泡分化受影響，ERβ的表達(dá)減少增加了ERα的表達(dá)，同時抑制素的表達(dá)也減少。說明SMAD3敲除鼠卵泡形成受損與改變基因的表達(dá)有關(guān)，如控制細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生存和細(xì)胞分化。SMAD3不足也導(dǎo)致雌二醇水平降低和FSH水平升高。SMAD3敲除鼠的卵巢沒有黃體，其在伴有外源性促性腺激素的排卵反應(yīng)下仍沒有排卵發(fā)生。這些研究表明小鼠生育能力下降。SMAD3敲除鼠卵泡生長受損，陰道閉鎖，高FSH水平及FSHR的正常表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白D2低表達(dá)，均提示在小鼠卵巢內(nèi)可能存在著SMAD3與FSH及FSHR下游信號之間的互動[23]。SMAD4卵巢條件性敲除鼠卵泡形成受阻，卵巢發(fā)育不良，生育能力受損。類固醇的調(diào)節(jié)被破壞，血中類固醇水平增加，卵丘細(xì)胞嚴(yán)重缺乏，這些發(fā)現(xiàn)說明，通過干擾SMAD4在卵巢顆粒細(xì)胞的信號，最終導(dǎo)致黃體化顆粒細(xì)胞形成過早和卵巢功能早衰，暗示TGF-β超家族信號通路是在體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞分化的時機扮演關(guān)鍵的角色[24-25]。SMAD家族其他成員也參與生殖系統(tǒng)的形成與發(fā)育，現(xiàn)正在進(jìn)一步研究中。

2.2.3變性基因叉頭框L2基因（forehead box L2，F(xiàn)OXL2）是第1個被認(rèn)定在維持卵巢功能方面發(fā)揮重要作用的人類常染色體基因。FOXL2基因位于細(xì)胞核內(nèi)，是一個2.7 kb的單外顯子基因，位于3q23區(qū)域。這個藏在人類體內(nèi)的“變性基因”可以讓人類保持性別特征，但如果FOXL2出現(xiàn)異常，女性身體則有可能長出男性的睪丸及胡子。小鼠的基因表達(dá)研究表明FOXL2表達(dá)僅限于發(fā)育中的眼瞼、卵巢顆粒細(xì)胞及垂體促甲狀腺及促性腺細(xì)胞。其局部表達(dá)的缺失可導(dǎo)致雙眼瞼的發(fā)育異常。FOXL2的完全性敲除顯示顱面（眼瞼）的缺失，卵泡形成受損及圍生期致死率高[26]。利用Cre/Loxp技術(shù)敲除小鼠促性腺組織中的FOXL2，發(fā)現(xiàn)雌鼠及雄鼠FSH合成明顯減少，且由于排卵減少，精子形成受阻，生育能力較低[27]，表明FOXL2是體內(nèi)FSH合成至關(guān)重要的且細(xì)胞自發(fā)性的調(diào)節(jié)器。

2.2.4激活素樣激酶2（activin-like kinase 2，ALK2）ALK2條件性敲除鼠的相關(guān)研究表明，ALK2雖然不是胚胎植入時的必需分子，但其在胚胎植入后子宮基質(zhì)蛻膜化過程中極為重要，在子宮內(nèi)敲除該分子后妊娠小鼠蛻膜形成受阻[28]。盡管ALK2與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）不是唯一的配體與受體，將BMP2條件性敲除后也會干擾妊娠小鼠蛻膜形成[29]。

2.2.5自噬相關(guān)基因正常小鼠在卵巢內(nèi)可誘發(fā)自噬反應(yīng)，自噬系統(tǒng)可保護(hù)初生鼠卵巢中的生殖細(xì)胞過度丟失。最近研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞特異性自噬相關(guān)基因7（autophagy-related gene 7，Atg7）敲除鼠體內(nèi)的自噬反應(yīng)被破壞后，在新生兒過渡期卵母細(xì)胞則丟失過多[30]，由于卵巢的發(fā)育不良導(dǎo)致小鼠生育能力低下。

3　問題與展望

可以看出，基因敲除技術(shù)近些年來得到了迅猛發(fā)展，而基因敲除在生殖系統(tǒng)中的應(yīng)用也將會是未來研究的熱點。敲除的生殖激素及相關(guān)分子不但對生殖系統(tǒng)的發(fā)育及胚胎形成至關(guān)重要，對一些婦科性腺激素依賴性疾病如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥及一些婦科惡性腫瘤等也有一定的影響。目前基因敲除技術(shù)應(yīng)用于生殖系統(tǒng)的研究仍不夠廣泛，未來可以將生殖激素、受體基因以及參與生殖發(fā)育的相關(guān)因子部分或完全敲除來進(jìn)行一系列系統(tǒng)性實驗，構(gòu)建參與生殖系統(tǒng)組成的分子網(wǎng)絡(luò)，并尋找有效的基因修復(fù)方法逆轉(zhuǎn)生殖缺陷，可更明確地了解這些分子的生物學(xué)功能及其在不同疾病中的作用機制，對研究生殖系統(tǒng)發(fā)育異常及激素依賴性疾病的發(fā)生機制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Hasegawa Y，Daitoku Y，Mizuno S，et al. Generation and characterization of Ins1 -cre -driver C57BL/6N for exclusive pancreatic beta cell -specific Cre -loxP recombination [J]. Exp Anim，2014，63（2）：183-191.

[2]Scharfenberger L，Hennerici T，Király G，et al. Transgenic mouse technology in skin biology: generation of complete or tissue -specific knockout mice[J]. J Invest Dermatol，2014，134（1）：e16.

[3]Yasuda H，Kobayashi S，Costa DB. EGFR exon 20 insertion mutations in non -small -cell lung cancer: preclinical data and clinical implications[J]. Lancet Oncol，2012，13（1）：e23-e31.

[4]Baumann K. Gene expression: RNAi as a global transcriptional activator[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（5）：298.

[5]Gaj T，Gersbach CA，Barbas CF 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/ Cas-based methods for genome engineering[J]. Trends Biotechnol，2013，31（7）：397-405.

[6]Sommer D，Peters AE，Wirtz T，et al. Corrigendum: Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases [J]. Nat Commun，2015，6：5927.

[7]Hsu PD，Lander ES，Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering [J]. Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[8]Barrangou R，F(xiàn)remaux C，Deveau H，et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes [J]. Science，2007，315（5819）：1709-1712.

[9]Marraffini LA，Sontheimer EJ. CRISPRinterference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA [J]. Science，2008，322（5909）：1843-1845.

[10]Ma Y，Zhang X，Shen B，et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9[J]. Cell Res，2014，24（1）：122-125.

[11]Kumar TR. FSHbeta knockout mouse model: a decade ago and into the future[J]. Endocrine，2009，36（1）：1-5.

[12]Abel MH，Widen A，Wang X，et al. Pituitary gonadotrophic hormone synthesis, secretion, subunit gene expression and cell structure in normal and follicle-stimulating hormone β knockout, follicle -stimulating hormone receptor knockout, luteinising hormone receptor knockout, hypogonadal and ovariectomised female mice[J]. J Neuroendocrinol，2014，26（11）：785-795.

[13]Cheong RY，Porteous R，Chambon P，et al. Effects of neuron -specific estrogen receptor (ER)α and ERβ deletion on the acute estrogen negative feedback mechanism in adult female mice [J]. Endocrinology，2014，155（4）：1418-1427.

[14]Kumar TR. Functional analysis of LHbeta knockout mice [J]. Mol Cell Endocrinol，2007，269（1/2）：81-84.

[15]Frye CA. Progesterone attenuates depressive behavior of younger and older adult C57/BL6, wildtype, and progesterone receptor knockout mice[J]. Pharmacol Biochem Behav，2011，99（4）：525-531.

[16]Willing J，Wagner CK. Sensorimotor development in neonatal progesterone receptor knockout mice [J]. Dev Neurobiol，2014，74 （1）：16-24.

[17]Christensen HR，Murawsky MK，Horseman ND，et al. Completely humanizing prolactin rescues infertility in prolactin knockout mice and leads to human prolactin expression in extrapituitary mouse tissues[J]. Endocrinology，2013，154（12）：4777-4789.

[18]Becker RO，Lazzari VM，Menezes IC，et al. Sexual behavior and dendritic spine density of posterodorsal medial amygdala neurons in oxytocin knockout female mice[J]. Behav Brain Res，2013，256：95-100.

[19]Sala M，Braida D，Donzelli A，et al. Mice heterozygous for the oxytocin receptor gene (Oxtr+/-) show impaired social behaviour but not increased aggression or cognitive inflexibility: evidence of a selective haploinsufficiency gene effect [J]. J Neuroendocrinol，2013，25（2）：107-118.

[20]Agmo A，Choleris E，Kavaliers M，et al. Social and sexual incentive properties of estrogen receptor alpha, estrogen receptor beta, or oxytocin knockout mice[J]. Genes Brain Behav，2008，7（1）：70-77.

[21]Lin M，Chen Y，Jin J，et al. Ischaemia -induced retinal neovascularisation and diabetic retinopathy in mice with conditional knockout of hypoxia -inducible factor -1 in retinal Müller cells[J]. Diabetologia，2011，54（6）：1554-1566.

[22]Semenza GL. Hypoxia -inducible factors in physiology and medicine[J]. Cell，2012，148（3）：399-408.

[23]Fortin J，Boehm U，Weinstein MB，et al. Follicle -stimulating hormone synthesis and fertility are intact in mice lacking SMAD3 DNA binding activity and SMAD2 in gonadotrope cells [J]. FASEB J，2014，28（3）：1474-1485.

[24]Li Q. Transforming growth factor β signaling in uterine development and function[J]. J Anim Sci Biotechnol，2014，5（1）：52.

[25]Yu C，Zhang YL，F(xiàn)an HY. Selective Smad4 knockout in ovarian preovulatory follicles results in multiple defects in ovulation[J]. Mol Endocrinol，2013，27（6）：966-978.

[26]Tran S，Zhou X，Lafleur C，et al. Impaired fertility and FSH synthesis in gonadotrope-specific Foxl2 knockout mice [J]. Mol Endocrinol，2013，27（3）：407-421.

[27]Justice NJ，Blount AL，Pelosi E，et al. Impaired FSHbeta expression in the pituitaries of Foxl2 mutant animals [J]. Mol Endocrinol，2011，25（8）：1404 -1415.

[28]Clementi C，Tripurani SK，Large MJ，et al. Activin-like kinase 2 functions in peri -implantation uterine signaling in mice and humans[J]. PLoS Genet，2013，9（11）：e1003863.

[29]Kashimada K，Pelosi E，Chen H，et al. FOXL2 and BMP2 act cooperatively to regulate follistatin gene expression during ovarian development[J]. Endocrinology，2011，152（1）：272-280.

[30]Song ZH，Yu HY，Wang P，et al. Germ cell-specific Atg7 knockout results in primary ovarian insufficiency in female mice [J]. Cell Death Dis，2015，6：e1589.

[本文編輯王琳]

Application of Knockout Female Mice in Reproductive System Research

QIN Zhi-juan，YANG Xiao-qing，ZHANG Yu-quan.
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，Jiangsu Province，China
Corresponding author：ZHANG Yu-quan，E-mail：jsnt_zhangyuquan@163.com

【Abstract】Gene knockout technology was developed in the second half of the 1980s through the homologous recombinant DNA technology, which played an important role in the research of gene function, developmental biology and diseases. Until now, the homologous recombination DNA technology is still the most popular way to build the knockout models. The knockout mice model has been most widely used. This article mainly reviews some important methods of gene knockout at home and abroad and their application in the study of female reproductive system, including the influence of sex hormone on reproductive organs and hormone -dependent diseases, the mechanisms of cytokines in the regulation of reproductive organs during puberty and gonad development and mature, as well as the defect in the gonadal development of embryo.

【Keywords】Mice，knockout；Urogenitalsystem；DNA，recombinant；Mutagenesis，insertional；RNAinterference

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81370677）

作者單位：226001南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

通信作者：張玉泉，E-mail：jsnt_zhangyuquan@163.com△審校者

收稿日期：（2015-07-30）