龍娜，李瑾，蔡博宇，肖克林，高亮，李慧，易紅，李曉紅

·論著·

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者種植窗期血清雌、孕激素水平和子宮內(nèi)膜端粒酶的表達

龍娜，李瑾，蔡博宇，肖克林，高亮，李慧，易紅，李曉紅

【摘要】目的：分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）患者種植窗期血清雌、孕激素水平和子宮內(nèi)膜端粒酶的表達，探討RSA病理生理學(xué)機制。方法：選擇2014年6月—2015年3月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院就診的RSA患者32例及正常妊娠女性25例作為研究對象，采用宮腔鏡檢查、化學(xué)發(fā)光法、免疫組化法和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，分別檢測種植窗期宮腔及子宮內(nèi)膜形態(tài)、血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平以及子宮內(nèi)膜中端粒酶含量。結(jié)果：①RSA患者中，宮腔鏡下表現(xiàn)為差型子宮內(nèi)膜者（腺體開口小或內(nèi)膜血管呈點狀或片狀分布，嚴重者內(nèi)膜呈雞蛋殼狀，未見明顯血管及腺體）占56.3%，腺體與間質(zhì)反應(yīng)不同步者占40.6%；在正常妊娠組中，表現(xiàn)為佳型子宮內(nèi)膜者（腺體開口大，極度擴張呈指環(huán)狀，且內(nèi)膜血管豐富呈網(wǎng)狀分布）占84%，腺體與間質(zhì)反應(yīng)同步者占88%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。②種植窗期端粒酶活性與E2/P比值呈線性相關(guān)（r=0.947 5），RSA組種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶活性較正常妊娠組明顯增強（P＜0.05）。③2組種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶在腺上皮細胞及間質(zhì)細胞均有表達，在腺上皮細胞中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在間質(zhì)細胞中RSA組較正常妊娠組增強（P＜0.05）。結(jié)論：①種植窗期宮腔鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)有助于了解及初步判定RSA患者子宮內(nèi)膜容受性，為查找病因提供依據(jù)。②種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶活性失調(diào)可能與RSA有關(guān)。③種植窗期檢測血清雌、孕激素及子宮內(nèi)膜端粒酶活性有助于評價RSA患者的子宮內(nèi)膜容受性，從而為改善及治療RSA提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】流產(chǎn)，習(xí)慣性；子宮內(nèi)膜；孕激素；端粒酶；種植窗

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：21-24，36）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)3次及3次以上的自然流產(chǎn)，連續(xù)發(fā)生2次自然流產(chǎn)其再次流產(chǎn)的風(fēng)險與3次自然流產(chǎn)相近[1]，發(fā)生率約1%～2%，其發(fā)生原因眾多且混雜，公認的RSA原因包括染色體異常、代謝性疾病、高齡母親、免疫性因素、子宮解剖異常和感染因素等，但仍有超過50%的患者未發(fā)現(xiàn)明確病因[2]。“種植窗”（window of implantation，WOI）是子宮內(nèi)膜對胚胎接受性達到最佳的一種狀態(tài)，通常為排卵后的6～8 d，僅維持48 h，在性激素調(diào)節(jié)下，種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)組織結(jié)構(gòu)和分泌蛋白都發(fā)生一系列變化，且其活性表達受雌、孕激素水平調(diào)控。本研究擬從子宮內(nèi)膜容受性細胞學(xué)機制探尋RSA的病因，研究采用宮腔鏡檢查、化學(xué)發(fā)光法、免疫組化法和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，分別檢測種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)、血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平以及子宮內(nèi)膜中端粒酶含量，進一步探討RSA的診治。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2014年6月—2015年3月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院生殖科就診有過2次及2次以上自然流產(chǎn)患者32例（RSA組），以及既往有過1次及以上正常妊娠女性25例（對照組）作為研究對象，2組平均年齡分別為（30.41±2.32）歲和（29.37±3.14）歲，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.438 5，P＞0.05）。納入標準：2組患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，月經(jīng)周期規(guī)律且有排卵，周期26～32 d；超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜未見明顯異常回聲；近3個月內(nèi)否認任何激素類藥物應(yīng)用史及宮腔內(nèi)手術(shù)操作史；排除傳染病活動期等相關(guān)疾??；RSA組至少有2次及以上流產(chǎn)史，夫妻雙方均完善RSA系統(tǒng)檢查，明確排除由男方因素、女方解剖因素、免疫因素及染色體因素引起的流產(chǎn)；對照組有過1次或以上正常生育史者。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查，并取得鈉入者簽署的知情同意書。

1.2方法

1.2.1子宮內(nèi)膜的獲取2組患者均于月經(jīng)第10天開始用尿黃體生成激素（LH）試紙檢測，于高峰出現(xiàn)前來院行超聲監(jiān)測排卵并明確排卵日，于排卵后6～10 d來院行宮腔鏡檢查，采用國產(chǎn)4 mm纖維宮腔鏡和德國Storz公司生產(chǎn)的影像系統(tǒng)，按Sakumoto等[3]的方法觀察子宮體和底部內(nèi)膜，最主要為后壁。根據(jù)子宮內(nèi)膜腺體開口及血管網(wǎng)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)進行分型。差型：腺體開口小或內(nèi)膜血管呈點狀或片狀分布，嚴重者內(nèi)膜呈雞蛋殼狀，未見明顯血管及腺體（見圖1）；佳型：腺體開口大，極度擴張呈指環(huán)狀，且內(nèi)膜血管豐富呈網(wǎng)狀分布（見圖2）。術(shù)中用活檢鉗于宮底部鉗取少許子宮內(nèi)膜組織，分成2份，一份放入甲醛液中固定，石蠟包埋后用于免疫組化染色，另一份放入一次性無菌試管中，立即置入-70℃冰箱中用于端粒酶TRAP-PCR檢測。

圖1　差型子宮內(nèi)膜

圖2　佳型子宮內(nèi)膜

1.2.2血清性激素測定宮腔鏡檢查當日抽取受檢者清晨空腹外周靜脈血3 mL，用于化學(xué)發(fā)光法測定血清中E2和P水平。

1.2.3子宮內(nèi)膜組織中的端粒酶的檢測采用免疫組化SP法檢測，端粒酶的兔抗人多克隆抗體購自上海邦景公司。操作方法參考SP試劑盒說明書。光鏡下觀察，端粒酶為細胞漿染色，陽性染色為棕黃色。每張切片選用5個400倍視野，采用Bisosens Digital Imaging System圖像分析儀和Image Pro Plus 5.0軟件進行圖像分析，測量端粒酶的陽性區(qū)光密度值，結(jié)果取平均值。

1.2.3.1子宮內(nèi)膜組織制備將待測組織物50 mg在冰凍狀態(tài)下以最快速度用研磨棒碾碎成粉末狀，放進DOUNCE勻漿器震蕩50 s，加入2～3 μL預(yù)冷的裂解液勻化80下，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，放進冰槽里孵育30 min，4℃微型臺式離心機離心10 min，速度為16 000×g（或13 000 r/min），小心移取上清液到新的無菌1.5 mL離心管，移取5 μL進行蛋白定量檢測，并采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA有無，提取的RNA立即進行端粒酶活性測定。

1.2.3.2端粒酶活性的檢測采用端粒酶實時熒光定量PCR技術(shù)，反應(yīng)體系總量為25 μL，移取15 μL反應(yīng)液到0.5 mL PCR管中。加入4 μL待測的細胞裂解懸液（嚴格避免RNA污染），加入2.5 μL染色液,再加入3.5 μL補充液到總量25 μL，放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5 s,使用1 000 μL帶濾芯槍頭加入1滴封隔夜,即刻放入熒光定量PCR儀，TRAP實時定量檢測試劑盒購自美國杰美基因大中華區(qū)銷售總代理。反應(yīng)條件如下：端粒延伸30℃20min，然后95℃預(yù)變性30s，60℃1.90 s，35個循環(huán)。采集數(shù)據(jù)進行分析，PCR產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。定性資料組間比較采用X2檢驗，定量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)比較的t檢驗，各指標間關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。檢驗水準為α=0.05。

2　結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜形態(tài)及反應(yīng)情況種植窗期宮腔鏡直視下RSA組子宮內(nèi)膜形態(tài)為佳型內(nèi)膜的患者比例低于對照組，病理學(xué)下內(nèi)膜腺體與間質(zhì)反應(yīng)同步率也低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1　2組患者種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)及反應(yīng)同步性比較例（%）

2.2端粒酶定量用標準品293細胞（人胚腎細胞，10 000，1 000，100和10的細胞數(shù)）作為陽性對照，以此建立標準曲線，見圖3。將待測的標本按1.2.3.2步驟經(jīng)實時熒光定量PCR擴增后得到S型擴增曲線及每個樣本的循環(huán)數(shù)，即Ct值，見圖4。將得到的Ct值代入標準曲線計算公式Y(jié)=mX+b，斜率（m）為-1.61，X為Ct值，Y軸截距（b）為42.13，計算Y值，即端粒酶的相對含量（表2中的TE）。舉例如下：依據(jù)標準曲線圖3中b為42.13, m為-1.61，X為26.15，得到Y(jié)值0.028 5。

圖3　標準品293細胞建立的標準曲線

2.3種植窗期血清激素及子宮內(nèi)膜端粒酶mRNA水平2組各項指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，RSA組E2和E2/P以及TE均高于對照組，P水平低于對照組，見表2。TE含量與E2/P值呈線性正相關(guān)（r=0.947 5，t= 10.151，P=0.000 3）。

圖4　端粒酶實時定量PCR擴增曲線

表2　2組患者種植窗期血清E2、P及子宮內(nèi)膜組織中端粒酶mRNA表達比較?。ā纒）

表2　2組患者種植窗期血清E2、P及子宮內(nèi)膜組織中端粒酶mRNA表達比較?。ā纒）

組別　n　E2(ng/mL) P（nmol/mL）　E2/P　TE RSA組　32 518.02±27.58 42.93±5.32 12.20±1.43 0.026 3±0.026對照組25 501.18±30.19 52.76±3.15 09.52±0.70 0.006 7±0.006 t 2.190　8.177　8.590　3.730 P 0.030　0.000　0.000　0.000

2.4種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶免疫組化結(jié)果種植窗期子宮內(nèi)膜內(nèi)端粒酶在RSA組及對照組的腺上皮細胞及間質(zhì)細胞均見表達，且2組腺上皮細胞中端粒酶表達含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而間質(zhì)細胞中的端粒酶表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RSA組高于對照組，見表3。光鏡下觀察端粒酶為細胞質(zhì)染色，箭頭示腺上皮細胞及間質(zhì)細胞的棕黃色染色，RSA組間質(zhì)細胞表達較對照組明顯。見圖5。

表3　2組患者種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶在腺上皮和間質(zhì)表達的比較?。ā纒）

表3　2組患者種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶在腺上皮和間質(zhì)表達的比較?。ā纒）

組別　n　腺上皮細胞　間質(zhì)細胞RSA組　32　1.44±0.23　0.61±0.14對照組　25　1.39±0.17　0.35±0.06 t 0.909　8.671 P 0.367　0.000

圖5　端粒酶蛋白在種植窗期子宮內(nèi)膜中腺上皮和間質(zhì)細胞的表達（SP×400）

3　討論

子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎種植的重要因素，子宮內(nèi)膜發(fā)育不良以及內(nèi)膜對胚泡植入容受性的降低，可能是導(dǎo)致生育能力低下和不良妊娠結(jié)局的原因之一[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)RSA女性較正常生育女性具有“超容受性”子宮內(nèi)膜[5]，而這種“超容受性”子宮內(nèi)膜引發(fā)了種植窗期的延伸，并降低了子宮內(nèi)膜對優(yōu)質(zhì)胚胎選擇的能力[6-7]，最終導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)。

3.1種植窗期宮腔鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)與RSA的關(guān)系子宮內(nèi)膜組織活檢是評價子宮內(nèi)膜形態(tài)的金標準，用于評價子宮內(nèi)膜與胚胎是否同步，子宮內(nèi)膜自身腺體與間質(zhì)的發(fā)育是否同步，宮腔鏡下種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)對于評價子宮內(nèi)膜容受性具有較高的診斷價值[8]。佳型且同步發(fā)育的子宮內(nèi)膜意味著內(nèi)膜腺體分泌旺盛，血供豐富，內(nèi)膜種植窗正好開放，有利于胚泡的種植及發(fā)育；而差型且不同步的子宮內(nèi)膜則意味著腺體和血管發(fā)育不良，不適宜早期的胚胎著床及發(fā)育，導(dǎo)致不孕或早期流產(chǎn)[9-10]。本研究結(jié)果表明RSA組的子宮內(nèi)膜差型多，不同步者多，說明子宮內(nèi)膜容受性差，可能是導(dǎo)致RSA的原因。

3.2種植窗期血清雌、孕激素、子宮內(nèi)膜端粒酶活性表達的相關(guān)性與子宮內(nèi)膜容受性研究表明雌、孕激素是形成良好子宮內(nèi)膜容受性的重要因素[11]，E2水平、E2/P比值的改變與子宮內(nèi)膜容受性改變有關(guān)，E2低水平或高水平均對種植窗口期的開放產(chǎn)生影響[12]。子宮內(nèi)膜端粒酶活性亦受雌、孕激素影響，E2濃度可直接影響人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）mRNA、端粒酶蛋白及外周血淋巴細胞端粒酶活性[13]。在整個月經(jīng)周期中端粒酶活性表達不同，在增生期其與雌激素水平呈正相關(guān)，自分泌期開始與孕激素水平呈負相關(guān)，在種植窗期孕激素達高峰，此時端粒酶無表達或是低水平，這種變化有利于胚胎的種植[14]。本研究中，種植窗期RSA組子宮內(nèi)膜端粒酶陽性表達率高于對照組，且表達量強，并與血清E2/P呈線性正相關(guān)（r=0.947 5）。因此，假設(shè)當在種植窗期子宮內(nèi)膜端粒酶活性表達增強后，有可能引起種植窗延長，進而對子宮內(nèi)膜的超容受性產(chǎn)生正向作用，或是在正常子宮內(nèi)膜容受下，端粒酶活性的增加加速了胚胎細胞的異常增殖和分化，而最終導(dǎo)致流產(chǎn)。

3.3端粒酶活性在子宮內(nèi)膜中的表達與流產(chǎn)在胚胎種植的過程中，囊胚通過黏附、穿透、種植等的一系列過程完成與母體子宮內(nèi)膜之間的對話，這些環(huán)節(jié)中的任何一個小的缺陷，如細胞增殖異常、細胞死亡、生物化學(xué)因素等均會導(dǎo)致胚胎種植失衡，進而出現(xiàn)或發(fā)育不良的子宮內(nèi)膜而導(dǎo)致胚胎無法發(fā)育或超容受性子宮內(nèi)膜對異常胚胎的接受而最終流產(chǎn)[15]。在本研究中，2組患者的端粒酶在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及間質(zhì)細胞均見表達，在腺上皮細胞中的表達較間質(zhì)細胞相似，但在間質(zhì)細胞中，正常對照組端粒酶表達量很低，RSA組患者端粒酶表達增強且失衡，而眾多的研究表明，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞是發(fā)生子宮內(nèi)膜蛻膜化的基本，且其具有識別優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì)胚胎的功能[5-7]，因此，筆者推測在種植窗期子宮內(nèi)膜中端粒酶活性表達增強及失衡可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。

在種植窗這一特定的時期，血清孕酮的峰值出現(xiàn)伴隨著端粒酶活性暫時性消失是為了適應(yīng)最大的子宮內(nèi)膜容受性，此時端粒酶活性的消失在最大程度上降低那些與增殖作用有關(guān)的細胞分化，以利于胚胎著床及植入[14]。綜上所述，種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的改變可能是引起RSA的重要原因之一，子宮內(nèi)膜端粒酶活性表達失調(diào)與RSA有關(guān)，種植窗期血清雌、孕激素及子宮內(nèi)膜端粒酶活性檢測有助于評價及了解RSA患者的子宮內(nèi)膜容受性，從而為改善及治療RSA提供臨床依據(jù)。

參考文獻

[1]李倩，梁曉燕.內(nèi)分泌異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2013，32（5）：327-329.

[2]Rai R，Regan L．Recurrent miscarriage [J]．Lancet，2006，368 （9535）：601-611.

[3]Sakumoto T，Inafuku K，Miyara M，et al．Hysteroscopic assessment of midsecretory-phase endometrium, with special reference to the luteal-phase defect[J]．Horm Res，1992，37（Suppl 1）：48-52．

[4]葉彩云，楊雪峰.多囊卵巢綜合征子宮內(nèi)膜容受性的研究進展[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2012，39（5）：491-494

[5]Salker M，Teklenburg G，Molokhia M，et al．Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss [J]．PLoS One，2010，5（4）：e10287．

[6]Teklenburg G，Salker M，Heijnen C，et al．The molecular basis of recurrent pregnancy loss:impaired natural embryo selction [J]．Mol Hum Reprod，2010，16（12）：886-895.

[7]Weimar CH，Kavelaars A，Brosens JJ，et al．Endometrial stromal cells of women with recurrent miscarriage fail to discriminate between high- and low-quality human embryos [J]．PLoS One，2012，7（7）：e41424．

[8]Fadare O，Zheng W．Histologic dating of the endometrium: accuracy, reproducibility, and practical value[J]．Adv Anat Pathol，2005，12（2）：39-46．

[9]Masamoto H，Nakama K，Kanazawa K．Hysteroscopic appearance of the mid -secretory endometrium: relationship to early phase pregnancy outcome after implantation [J]．Hum Reprod，2000，15 （10）：2112-2118．

[10]李素春，馮苗，潘萍，等.不明原因不孕患者著床窗期子宮內(nèi)膜容受性分析[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2009，25（7）：507-510.

[11]徐苗厚,張振國,江森,等.黃體功能缺陷與子宮內(nèi)膜效應(yīng)不良患者的內(nèi)分泌特征[J].中華婦產(chǎn)科雜志, 1997, 32（3）:141-144．

[12]Ma WG，Song H，Dash SK，et al．Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（5）：2963-2968．

[13]Benko AL，Olsen NJ，Kovacs WJ．Estrogen and telomerase in human peripheral blood mononuclear cells[J]．Mol Cell Endocrinol，2012，364（1/2）：83-88．

[14]Williams CD，Boggess JF，LaMarque LR，et al．A prospective, randomized study of endometrial telomerase during the menstrual cycle[J]．J Clin Endocrinol Metab，2001，86（8）：3912-3917．

[15]Hapangama DK，Turner MA，Drury JA，et al．Endometrial telomerase shows specific expression patterns in different type of reproductive failure [J]．Reprod Biomed Online，2008，17（3）：416-424．

[本文編輯李淑杰]

·論著·

Levels of Serum Estrogen and Progesterone and Expression of Endometrial Telomerase in RSA Patients

at Implantation Window

LONG Na，LI Jin，CAI Bo-yu，XIAO Ke-lin，GAO Liang，LI Hui，YI Hong，LI Xiao-

hong.
Department of Reproductive Health，Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital，School of Medicine, Jinan University, Shenzhen 518100，Guangdong Province，China
Corresponding author：LONG Na，E-mail：summer_long@126.com

【Abstract】Objective：To investigate the levels of sera estrogen and progesterone, and the expression level of endometrial telomerase, in those recurrent spontaneous abortion（RSA）patients in the window of implantation (WOI), so as to explore the pathophysiology of RSA. Methods：The endometrial samples were collected from 32 cases of RSA and 25 cases of normal pregnant women with the informed consent. The levels of sera estrogen and progesterone were tested by chemiluminescence. The endometrial morphology was checked by hysteroscopy. The expression level of endometrial telomerase the time of WOI was tested by immunohistochemistry and real-time PCR. Results：①56.3% patients of RAS had the so-called "bad type" endometrium under hysteroscopy, and 40.6% RSA patients had unsynchronous response in endometrial glands and stroma. In the control group, 84% women had the so-called "good type" endometrium, and 88% had synchronous response.②There was a linear correlation between the telomerase activity in the WOI and the E2/P ratio（r=0.947 5）. The telomerase activity in the RSA group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.③The expression of telomerase was found in both the epithelial cells and the stromal cells in the WOI endometrium. There was no significant difference in the telomerase expression in the epithelial cells between two groups（P＞0.05）, while the expression in the stromal cells of the RSA group was significantly increased when compared with the control group（P＜0.05）. Conclusions：①The endometrial morphology in the WOI under hysteroscopy is helpful to understand the endometrial receptivity of RSA patients.②The disorder of endometrial telomerase activity in the WOI may be related to RSA.③The levels of serum estrogen and progesterone combined with the endometrial telomerase activity were used to evaluate the endometrial receptivity, which is benefit to improve the treatment of RSA.

【Keywords】Recurrent spontaneous abortion；Endometrium；Progesterone；Telomerase; Window of implantation

基金項目：2014年深圳市寶安區(qū)科技計劃項目（2014075）

作者單位：518100廣東省深圳市，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寶安婦幼保健院生殖健康科

通信作者：龍娜，E-mail：summer_long@126.com

收稿日期：（2015-04-23）