紀(jì)留娟　錢志平　王介非

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·綜述·

代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝臟疾病中的研究進(jìn)展

紀(jì)留娟錢志平王介非

乙型肝炎病毒感染呈世界性分布，病程遷延不愈可發(fā)展為慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)，部分患者病情惡化可進(jìn)展為肝功能衰竭[1]。肝臟作為人體最重要的代謝器官，一旦發(fā)生疾病必然引起相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化，進(jìn)而影響到體內(nèi)眾多的內(nèi)源性小分子代謝物水平。檢測體液中的這些內(nèi)源性小分子物質(zhì)可作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)并且有助于分析和闡明肝臟疾病的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制[2]。系統(tǒng)生物學(xué)的分支—代謝組學(xué)可實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。本文就代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝臟疾病中近幾年的研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

一、代謝組學(xué)概述

(一)代謝組學(xué)含義代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)后出現(xiàn)的以定量描述生物體內(nèi)代謝物多參數(shù)變化為目標(biāo)的新興“組學(xué)”[3]。1999年Nicholson等[4]正式提出代謝組學(xué)的概念：可以定量測定生物體系對病理生理刺激或遺傳因素改變所產(chǎn)生的動態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的一種方法。它所關(guān)注的是代謝路徑中相對分子質(zhì)量在1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)，反映外界刺激或遺傳修飾下細(xì)胞或組織的代謝應(yīng)答變化[5]。著名學(xué)者German等[6]曾在他的文章中寫到: “基因組學(xué)反映了什么是可以發(fā)生的，轉(zhuǎn)錄組學(xué)反映的是將要發(fā)生的，蛋白質(zhì)組學(xué)指出了什么是賴以發(fā)生的，只有代謝組學(xué)才真正反映已經(jīng)發(fā)生的。” 代謝組學(xué)的優(yōu)勢在于其研究的是生物體中小分子物質(zhì)產(chǎn)生和代謝的最終結(jié)果, 而基因組、蛋白質(zhì)組則具有累加性和補(bǔ)償作用, 他們有效的微小變化都會在代謝物上得到放大。因此,代謝物的識別更容易、更能準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)。

(二)代謝組學(xué)的研究方法根據(jù)研究對象和目的不同，F(xiàn)iehn等[7]將代謝產(chǎn)物分析分為代謝物靶標(biāo)分析、代謝輪廓分析、代謝組學(xué)及代謝指紋分析4個層次。嚴(yán)格地說，只有第三層次才是嚴(yán)格意義上的代謝組學(xué)研究。

目前，代謝組學(xué)分析平臺主要有液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS) 、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS) 、核磁共振技術(shù)( NMR) 3 種。它們各有優(yōu)缺點(diǎn)：LC-MS技術(shù)對待測組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性沒有要求，前期處理簡單，可進(jìn)行快速高效的檢測，但缺少可以參考的標(biāo)準(zhǔn)譜庫，代謝物鑒定需借助標(biāo)準(zhǔn)品，鑒別相對困難； GC-MS 技術(shù)具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，可用于代謝產(chǎn)物定性，但是對于揮發(fā)性低的樣品需做衍生化處理，前期處理復(fù)雜繁瑣且可能會導(dǎo)致某些物質(zhì)信號的丟失；NMR分為氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)和磷譜(31P-NMR)。NMR技術(shù)樣品前處理簡單，對樣品中小分子代謝物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)無破壞性，因此可較全面地分析樣本成分，不具有偏向性，但其靈敏度較低，難以準(zhǔn)確地進(jìn)行定量分析，不大適用于大量低豐度代謝物的分析。由于代謝物的多樣性與復(fù)雜性，目前并沒有一個單一的技術(shù)可以同時測定和識別樣品中所有的代謝物，所以需綜合各分析平臺的數(shù)據(jù)以得到更全面的代謝物信息。

應(yīng)用生物分析技術(shù)獲得原始數(shù)據(jù)后，需要應(yīng)用一系列的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對其進(jìn)行分析，目前最常用的模式識別方法包括主成分分析(PCA)、分層聚類分析( HCA)等無監(jiān)督模式識別方法和正交偏最小二乘法(0PLS)，偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、隨機(jī)森林分析(RF)等有監(jiān)督模式識別方法。其中，PCA、PLS-DA、 OPLS-DA 使用最廣泛。

迄今為止，國內(nèi)外已有許多學(xué)者對HBV相關(guān)肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)和肝衰竭患者開展代謝組學(xué)研究，以便能更全面了解HBV相關(guān)肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的物質(zhì)變化規(guī)律。

二、代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝臟疾病研究中的應(yīng)用

(一)代謝組學(xué)在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌中的應(yīng)用

1. 慢性乙型肝炎HBV在我國流行已超過半個世紀(jì)，因早年缺乏抗病毒藥物，故當(dāng)前臨床所遇到的許多病例已由乙肝病毒攜帶者進(jìn)展為慢性乙型肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。侯玉潔等[8]對慢性乙型肝炎患者、健康對照者血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)檸檬酸、烏頭酸、谷氨酰胺、N，N-二甲基甘氨酸、丙二酸可作為區(qū)分慢性乙型肝炎患者和正常人的潛在標(biāo)志物，這些差異代謝物涉及慢性乙型肝炎患者體內(nèi)糖、氨基酸及脂類三大物質(zhì)代謝異常，與免疫功能及體內(nèi)有氧呼吸代謝過程有密切關(guān)系。Zhang等[9]對慢性乙型肝炎患者、健康對照者尿液標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)生物素砜、5-氧代二十一烷酸、d-葡糖胺、2-甲基庚酸在慢性乙型肝炎組和健康對照組尿液中存在明顯差異。推測這些差異代謝物與乙型肝炎病毒干擾細(xì)胞色素P450、苯丙氨酸、氨基糖及核苷酸糖等的代謝通路相關(guān)。Gao等[10]發(fā)現(xiàn)苯基丙氨酸、蘋果酸、5-甲氧色胺可準(zhǔn)確地將慢性乙型肝炎組與健康對照組歸類。Shao等[11]對慢性乙型肝炎感染不同階段的血清進(jìn)行代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)甘氨膽酸、牛磺膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸、膽綠素、羰基癸烯酸和溶血磷脂酰膽堿是免疫清除期特異的臨床指標(biāo)，它們對于判斷CHB患者是否處于免疫清除期有較高的敏感性和特異性。而油酰胺可作為非活動期的生物標(biāo)志物。這些潛在的生物標(biāo)志物在肝細(xì)胞的損傷和修復(fù)，能量代謝，脂肪酸和膽汁酸的生物合成和炎癥的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，它們有望代替肝組織活檢用于鑒別CHB處于何種臨床分期的判斷，可為判斷慢性乙型肝炎感染免疫清除期提供新的診斷標(biāo)志物，對指導(dǎo)抗病毒治療具有十分重要的意義。

2. 慢性乙型肝炎相關(guān)肝硬化肝硬化患者往往由于肝功能失代償,常存在腹水、上消化道出血等一系列并發(fā)癥而需要住院治療,對公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅。肝硬化的病因種類繁多，有學(xué)者嘗試?yán)么x組學(xué)方法進(jìn)行病因區(qū)分。Qi等[12]采用核磁共振(NMR)方法檢測21例乙肝肝硬化患者、20例酒精性肝硬化患者和20例健康對照者的血清代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌酸、乙酰乙酸、異丁酸鹽、谷氨酰胺和谷氨酸在乙肝肝硬化患者和酒精性肝硬化患者之間存在明顯差異，可作為兩種疾病診斷的特異性標(biāo)志物，并為探討乙肝肝硬化和酒精性肝硬化的發(fā)病機(jī)理提供了一種新的技術(shù)方法。Gao等[10]采用氣相色譜飛行時間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)技術(shù)對健康對照組、慢乙肝組、肝硬化組、肝癌組進(jìn)行血清代謝組學(xué)分析，鑒定出包含在氨基酸代謝、能量代謝及檸檬酸循環(huán)等關(guān)鍵性的代謝通路當(dāng)中的15種血清代謝物。經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)棕櫚酸在慢乙肝組和肝硬化組存在明顯差異，天冬酰胺酸、β-谷氨酸鹽可準(zhǔn)確區(qū)分肝硬化組和肝癌組。Mark等[13]納入失代償期肝硬化患者80例(62例存活，18例死亡)進(jìn)行血漿代謝分析，顯示非存活組磷脂酰膽堿和脂質(zhì)減少；乳酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸信號增強(qiáng)。磷脂酰膽堿和氨基酸失調(diào)與死亡率升高和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，血漿代謝分析可準(zhǔn)確預(yù)測失代償期肝硬化患者的死亡率。Dabos等[14]發(fā)現(xiàn)乙酰乙酸、β-羥丁酸、谷氨酸、乳酸、丙酮酸、蘇氨酸、天門冬氨酸在乙肝肝硬化組比正常對照組明顯升高，谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸則明顯降低。推測乙肝肝硬化患者的酮體代謝、尿素循環(huán)及糖異生存在明顯障礙。

3. 慢性乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌HCC的發(fā)生是一個漸進(jìn)的過程，常隱匿起病，出現(xiàn)臨床癥狀往往已到晚期，死亡率極高，因而如何早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療已成為肝癌研究的重點(diǎn)。AFP在臨床上應(yīng)用最廣，但其檢測靈敏度還不到70%且不具有特異性，因此，急需尋找新的特異標(biāo)志物用于HCC的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后判斷[15]。Liu等[16]對HBV相關(guān)HCC患者的腫瘤標(biāo)本勻漿液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤中央組織和遠(yuǎn)癌組織中14 個代謝物差異顯著，其中包括9個已經(jīng)報(bào)道的代謝物[17, 18]和5個未曾報(bào)道的代謝物(β-谷甾醇、喹哪啶酸、花生肉堿、肉豆蔻醛和油酸酰胺)。推測這些代謝物與遠(yuǎn)癌組織向中央癌組織的發(fā)展變化過程有關(guān)并為抗癌研究提供了新的靶標(biāo)。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)刀豆氨酸琥珀酸在乙肝肝硬化患者中顯著降低而在HCC患者中是明顯升高的，可作為區(qū)分肝癌與肝硬化患者的診斷指標(biāo)；甘氨鵝脫氧膽酸可作為在HBV相關(guān)HCC的早期診斷及疾病治療監(jiān)測的特征性生物標(biāo)志物。Lu等[20]發(fā)現(xiàn)HCC組中脂肪酸、長鏈?；鈮A明顯升高，碳水化合物、氨基酸、短中鏈?；鈮A含量明顯高于健康對照組。精氨酸聯(lián)合棕櫚酰肉堿診斷乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌的敏感性和特異性分別高達(dá)97.3%和100%。Li等[21]對乙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞癌宿主細(xì)胞HepG2.2.15和HepG2進(jìn)行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)11個代謝物存在顯著差異。N-乙酰氨基葡萄糖激酶在HepG2.2.15的表達(dá)顯著增加,證明己醣胺生物合成途徑在乙肝病毒感染細(xì)胞中被激活,為未來研究乙型肝炎病毒感染靶向治療提供了一個新思路。

(二)代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝衰竭中的應(yīng)用

肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候[22]。利用代謝組學(xué)的方法來研究肝衰竭患者體液代謝物的變化規(guī)律對于肝衰竭早期診斷、闡明肝衰竭發(fā)病機(jī)制、評估病情嚴(yán)重程度、早期判斷患者預(yù)后具有重要臨床意義。

1. 代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用肝衰竭的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今國內(nèi)外有很多學(xué)者都是從基因水平研究肝衰竭的發(fā)病機(jī)制。利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測肝衰竭動物或患者的代謝物譜能夠反映出肝臟以及全身的代謝途徑的改變，進(jìn)而可以從基因產(chǎn)物(各種代謝物質(zhì))的水平來闡明機(jī)制。Yu等[23]對24例由乙型肝炎病毒引起的急性肝衰竭病人和23例健康對照者進(jìn)行了血清代謝組學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝衰竭組氨基酸、葡萄糖表現(xiàn)的色譜圖與健康人明顯不同。推測是由于正常的肝臟能夠合成、儲存、分解糖原維持血糖平衡，而肝衰竭患者肝糖原的合成與儲存均減少，從而多種糖類濃度下降,因此通過識別氨基酸、葡萄糖色譜圖可早期區(qū)分肝衰竭患者。研究還發(fā)現(xiàn)多種氨基酸濃度升高，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸下降，此結(jié)論與以往肝衰竭發(fā)病時出現(xiàn)支鏈氨基酸芳香族氨基酸代謝紊亂的研究結(jié)論一致。Amathieu等[24]利用NMR結(jié)合OPLS數(shù)據(jù)分析對30例乙肝肝硬化基礎(chǔ)上慢加急性肝衰竭患者(ACLF)和93例慢性肝衰竭患者的血清進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)ACLF組中乳酸、丙酮酸、酮體、谷氨酰胺明顯升高，而高密度脂蛋白含量明顯低于CLF組。

代謝組學(xué)的研究進(jìn)一步闡明了肝衰竭是一種擾亂糖類、脂類、氨基酸等多種重要代謝途徑的復(fù)雜綜合征。因此代謝組學(xué)可以闡述肝衰竭發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，也可為肝衰竭的早期診斷提供新的方法，同時鑒定了與HBV相關(guān)肝衰竭嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。

2. 代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝衰竭早期診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評估中的應(yīng)用HBV相關(guān)肝衰竭患者的病情兇險(xiǎn)，病死率高，對其進(jìn)行早期診斷、準(zhǔn)確評估、及時治療至關(guān)重要。在臨床實(shí)踐中，肝衰竭的診斷基于高膽紅素血癥和凝血時間的延長，但是以上兩個指標(biāo)不能完全反映肝臟的功能，對肝衰竭的早期診斷具有局限性[25, 26]。基于多變量數(shù)據(jù)分析的代謝組學(xué)在肝衰竭的早期診斷以及發(fā)現(xiàn)肝衰竭的診斷標(biāo)志物方面具有顯著優(yōu)勢。MAO等[27]運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)對24例HBV相關(guān)肝衰竭患者和23例健康對照者進(jìn)行代謝組學(xué)研究，研究發(fā)現(xiàn)甘油酸、順式烏頭酸、檸檬酸可被鑒定為診斷肝衰竭的潛在生物標(biāo)志物。提示HBV相關(guān)肝衰竭患者的肝細(xì)胞線粒體損傷，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)出現(xiàn)紊亂。Zhang等[28]采用氣相色譜質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)結(jié)合主成分分析方法(PCA)及質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(MRM)對26例HBV相關(guān)肝衰竭患者和16例健康志愿者的血清進(jìn)行代謝物譜分析, 發(fā)現(xiàn)主成分分析模型能區(qū)分肝衰竭組與健康對照組；同時又對165例患者進(jìn)行驗(yàn)證，模型預(yù)測肝衰竭特異度和敏感度分別高達(dá)94.3%和100%。

目前常用CTP評分系統(tǒng)和MELD評分系統(tǒng)對肝衰竭患者的嚴(yán)重程度進(jìn)行評估，但是以上兩種評分系統(tǒng)沒有完全考慮到肝衰竭時患者代謝的紊亂，其預(yù)測的準(zhǔn)確性和操作的簡易性尚存在爭議，臨床運(yùn)用存在局限性。Nie等[29]發(fā)現(xiàn)與慢性乙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組、正常對照組相比，HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭組中溶血磷脂酸 (P-16:0e/0:0) 、溶血磷脂酸(18:0e/0:0)明顯升高，溶血卵磷脂、卵磷脂(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)e/2:0)和卵磷脂(16:0/18:2(9Z,12Z))明顯降低。溶血卵磷脂、溶血磷脂酸、磷脂酸含量的變化趨勢和肝臟疾病的嚴(yán)重程度是一致的，可以作為預(yù)測ACLF 預(yù)后的潛在標(biāo)志物。Amathieu 等[30]應(yīng)用1H-NMR結(jié)合PCA軟件對124例HBV相關(guān)慢性肝功能衰竭(CLF)患者血清樣本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)多種代謝物在肝衰竭病變程度不同時有顯著差異，磷酸膽堿和高密度脂蛋白在重度慢性肝衰竭患者(MELD評分>35分)血清中明顯低于輕度慢性肝衰竭患者(MELD評分<6分)，而丙酮酸、乳酸及肌酸明顯升高。其中肌酸是機(jī)體內(nèi)能量轉(zhuǎn)移過程中的一個重要成分，現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為是評估肝臟損傷的一個非常靈敏的指標(biāo)，可用于對肝衰竭患者肝損傷嚴(yán)重程度的評估[31]。Liu等[32]采用氣相色譜質(zhì)譜結(jié)合典型判別分析(CDA)對乙型肝炎肝衰竭進(jìn)行代謝組學(xué)研究，能夠?qū)⒉煌瑖?yán)重程度的肝衰竭患者明顯區(qū)分，從而判斷肝衰竭的嚴(yán)重程度，其判斷的正確率達(dá)到了91．7%，較常規(guī)的血清酶學(xué)診斷正確率(75%)有明顯的提高。

3. 代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝衰竭并發(fā)肝性腦病中的應(yīng)用

肝性腦病是肝衰竭患者最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致肝衰竭患者死亡的主要原因，目前其發(fā)病機(jī)制并不十分明確，主要有氨中毒學(xué)說、氨基酸代謝異常、假性神經(jīng)遞質(zhì)形成及氨基丁酸學(xué)說等[33, 34]。齊等[35]采用NMR方法對乙型肝炎肝硬化患者和輕微肝性腦病(MHE)患者的血清代謝物進(jìn)行檢測，并用臨床標(biāo)本驗(yàn)證了代謝組模型診斷MHE的可行性。OPLS-DA模型顯示:與肝硬化組相比，MHE組患者血清中的谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙酮增高，纈氨酸和異亮氨酸降低。谷氨酰胺具有神經(jīng)毒性，能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性與能量代謝，也是評估肝性腦病嚴(yán)重程度的一個重要指標(biāo)。纈氨酸和異亮氨酸濃度降低，苯丙氨酸水平升高，提示肝性腦病時，芳香族氨基酸(AAA)在腦內(nèi)增加，而支鏈氨基酸(BCAA)水平降低。Dabos等[14]采用NMR技術(shù)對乙型肝炎肝硬化組、肝性腦病組、健康對照組進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)肝性腦病組比正常組亮氨酸明顯升高。肝性腦病組谷氨酰胺、甘油、肌醇比肝硬化組明顯降低，β-羥丁酸、乙酰乙酸、亮氨酸、異亮氨酸則比肝硬化組明顯升高。丙酮[35]、乙酰乙酸、β-羥基丁酸濃度升高說明發(fā)生肝性腦病時腦細(xì)胞酮體利用發(fā)生障礙。代謝組學(xué)技術(shù)可同時檢測患者血清中多種代謝物質(zhì)，能夠提供系統(tǒng)的、完整的代謝物變化情況，有助于從分子水平研究肝性腦病的病理形成機(jī)制，可能為肝性腦病的診斷提供一種新的手段。

三、小結(jié)與展望

代謝組學(xué)的發(fā)展已不斷的趨于成熟，其相比較于傳統(tǒng)的診斷方法及蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)更有優(yōu)勢。該技術(shù)只要采集患者的尿液、糞便、血液或組織樣本即可進(jìn)行檢測，是一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)成本低、無創(chuàng)的檢驗(yàn)方法。代謝組學(xué)在HBV相關(guān)肝臟疾病的研究中也顯示出了巨大的潛力，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于慢性乙型肝炎，HBV相關(guān)肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝衰竭及肝性腦病等各種肝臟疾病的研究中。但由于代謝組學(xué)還處于初步發(fā)展階段，各種分析技術(shù)仍需要進(jìn)一步完善。相信未來伴隨著更高通量、高靈敏度檢測手段和更高效的數(shù)據(jù)分析方法的整合應(yīng)用，以及與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等各組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用，其在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、療效評估、預(yù)后預(yù)測等方面將有更重要的價(jià)值。

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(本文編輯：張苗)

國家十二五科技重大專項(xiàng)(2012ZX10005)

200083上海復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心重癥肝病&ICU科

錢志平，Email: qianzhiping@shaphc.org

2016-05-18)