陳沖　張毅　卓其斌　陳良

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·綜述·

乙型肝炎核心抗體定量檢測(cè)的研究進(jìn)展

陳沖張毅卓其斌陳良

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，世界上有超過(guò)20億HBV感染者和大約3.78億慢性HBV患者，每年大約450萬(wàn)HBV新發(fā)感染[1]。我國(guó)是HBV感染的中高流行區(qū)，2006年全國(guó)乙肝血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)的慢性HBV攜帶率為7.18%，而乙型肝炎一旦慢性化后，10%～20%可發(fā)展為肝硬化，部分轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦透窝住⒏嗡ソ? 1%～5%可演變?yōu)楦伟┒＜吧黐2]。由此看來(lái)，優(yōu)化乙型病毒性肝炎HBV的診治是一項(xiàng)非常重要和艱巨的任務(wù)。

乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)對(duì)應(yīng)的抗體，HBcAg在乙型肝炎病毒感染后即可編碼產(chǎn)生，其免疫原性極強(qiáng)，在急性乙型肝炎早期即可達(dá)高峰值，HBcAg感染的肝細(xì)胞是細(xì)胞免疫效應(yīng)攻擊的靶細(xì)胞，故HBcAg含量與肝臟損害程度相關(guān)，也是HBV病毒復(fù)制的有力證據(jù)。HBcAg主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)和血清Dane顆粒中，HBcAg與抗-HBc具有很強(qiáng)的親和力，能迅速結(jié)合形成免疫復(fù)合物，故難以在血清中測(cè)得游離的HBcAg，所以臨床上以檢測(cè)抗-HBc來(lái)間接反應(yīng)HBcAg水平[3-5]。然而既往研究中對(duì)抗-HBc的檢測(cè)均采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法和間接法，其檢測(cè)敏感度和特異度欠佳，臨床應(yīng)用價(jià)值有限[6]。近年來(lái)，隨著抗-HBc檢測(cè)方法學(xué)的進(jìn)展，抗-HBc水平定量分析的臨床價(jià)值已受到越來(lái)越多關(guān)注。本文就目前抗-HBc定量對(duì)乙型肝炎的臨床診斷、治療效果評(píng)價(jià)等相關(guān)研究進(jìn)展及臨床意義進(jìn)行如下綜述。

一、抗-HBc檢測(cè)方法學(xué)研究進(jìn)展

(一)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定(ELISA)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物的方法很多，其中以酶聯(lián)免疫吸附法最為常見(jiàn)。雖然ELISA試劑盒的靈敏度和特異性較好，但比較耗時(shí)、過(guò)程較為復(fù)雜、且價(jià)格相對(duì)昂貴[7]。近年來(lái)開(kāi)發(fā)了一種新型的雙抗原夾心ELISA檢測(cè)抗-HBc，其原理為應(yīng)用重組乙型肝炎核心抗原(rHBcAg)固定在固相載體上，并結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶(HRP-HBcAg)進(jìn)行檢測(cè)，rHBcAg在大腸桿菌中表達(dá)，利用單克隆抗體特異的親和層析來(lái)純化，其純度和特性通過(guò)SDS-PAGE，Western印跡和ELISA分析獲得，蛋白濃度的測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析，純化的rHBcAg與HRP偶聯(lián)以獲得捕獲抗-HBc的能力，此雙抗原夾心ELISA相當(dāng)于半定量測(cè)定血清中抗-HBc，實(shí)驗(yàn)用血清樣本從地區(qū)醫(yī)院采集，可靠性高，通過(guò)平行對(duì)照來(lái)比較競(jìng)爭(zhēng)性ELISA與雙抗原夾心ELISA測(cè)定抗-HBc的特異性和敏感性，結(jié)果顯示，雙抗原ELISA獲得98.4%的良好檢測(cè)效果，比競(jìng)爭(zhēng)性ELISA表現(xiàn)更敏感[8]。然而ELISA這種半定量檢測(cè)特異性抗體的方法只涉及總抗體活性的檢測(cè)(相當(dāng)于簡(jiǎn)單的定性)，而對(duì)抗體親和力或抗體含量的分析遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其是當(dāng)需要定量抗-HBc評(píng)估患者的免疫狀態(tài)時(shí)，精確的定量檢測(cè)方法顯得更為重要，故此雙抗原夾心ELISA檢測(cè)法的應(yīng)用存在一定局限性。

(二)化學(xué)發(fā)光免疫微粒分析法(CMIA)化學(xué)發(fā)光免疫微粒分析法進(jìn)行抗-HBc定量測(cè)定在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用也逐漸增多，是利用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體的免疫分析方法，以HRP為標(biāo)記酶，HRP與待測(cè)抗-HBc的血清樣本加入到固相載體上，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合來(lái)測(cè)定抗-HBc，再加入發(fā)光底液后由化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放，將微孔板置入分析儀內(nèi)，通過(guò)儀器內(nèi)部的三維傳動(dòng)系統(tǒng)，依次由光子計(jì)數(shù)器讀出光子數(shù)，抗-HBc濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量分析。具體操作即可在連續(xù)稀釋的樣本中檢測(cè)抗-HBc活性、定量抗-HBc含量以及比較抗-HBc親和力。以樣本對(duì)臨界值(光譜)比值(S/CO)作為量化指標(biāo)，將稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成具有線(xiàn)性關(guān)系的算術(shù)數(shù)值(如2,20,200轉(zhuǎn)化成0.301,1.301,2.301等)，以各稀釋標(biāo)本檢測(cè)的臨界值作為X軸，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的計(jì)算值作為Y軸，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合，通過(guò)受試者特征曲線(xiàn)來(lái)記錄各稀釋樣本的量化值[9-10]。這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的使用大大節(jié)省了臨床及科研工作者的操作步驟，因?yàn)樵谝酝臋z測(cè)方法中，抗-HBc活性在抗體濃度不同的樣本中測(cè)量單位不同，其中高濃度和低濃度的血清樣本需分別進(jìn)行計(jì)算，而在此項(xiàng)技術(shù)中，不同濃度樣本檢測(cè)值的比率能夠反映抗體的親和力，避免進(jìn)一步建立復(fù)雜的數(shù)學(xué)建模，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，且通過(guò)ROC分析，也可以間接得出抗-HBc抗體的具體含量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS來(lái)分析，在確定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后，比較數(shù)據(jù)可以觀(guān)察到抗-HBc抗體活性、親和力、抗體含量有一定的關(guān)聯(lián)性，且抗-HBc與ALT，HBV DNA之間也存在一定相關(guān)性，這也表明CMIA用于抗-HBc檢測(cè)在臨床上可能具有更大的實(shí)用性。當(dāng)然也有研究人員認(rèn)為，對(duì)HBeAg陰性慢性HBV感染患者來(lái)說(shuō)，不應(yīng)首選CMIA，除非有確切的肝炎病毒活動(dòng)或者復(fù)制的證據(jù)，這種情況下，抗-HBc IgM抗體應(yīng)該由微粒酶免疫測(cè)定(MEIA)量化[11]，這是我們需要進(jìn)一步探討研究的地方,對(duì)不同情況的病人，CMIA檢測(cè)的可操作性和實(shí)用性有待大量實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步的數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估分析。

(三)時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)時(shí)間分辨熒光免疫分析近年也逐漸被應(yīng)用于測(cè)定抗體濃度，用鑭系元素Eu3-(銪)螯合物作為示蹤物標(biāo)記抗原或抗體，在免疫反應(yīng)完成后加入特殊的增強(qiáng)液，將Eu3-從標(biāo)記的抗原或抗體上解離下來(lái)，并與增強(qiáng)液中的組分形成新的具有強(qiáng)烈熒光的螯合物，用特定的儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而判斷反應(yīng)體系中被測(cè)物濃度。同時(shí)檢測(cè)時(shí)間和波長(zhǎng)兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可特異性排除非特異熒光的干擾，提高抗體檢測(cè)的靈敏度。與雙抗原夾心ELISA及CMIA相比，此法目前應(yīng)用較少，但這一項(xiàng)操作技術(shù)推廣到臨床用于檢測(cè)抗-HBc也是極具前景的。

二、抗-HBc定量水平與慢性乙型肝炎(CHB)自然病程的相關(guān)性

歐洲肝臟病協(xié)會(huì)將CHB的自然病程分為4個(gè)時(shí)期：免疫耐受期( IT)、免疫清除期(IC)、低復(fù)制或非復(fù)制期( LR)及HBeAg陰性慢性乙型肝炎期(ENH)，且CHB不同階段存在免疫學(xué)動(dòng)態(tài)變化[12]。近年各種新穎的檢測(cè)方法用來(lái)檢測(cè)乙型病毒性肝炎血清學(xué)標(biāo)志物，然而，具有實(shí)踐意義的用來(lái)表現(xiàn)宿主免疫狀態(tài)的生化標(biāo)志物始終不明確[13]。

抗-HBc定量已被廣泛應(yīng)用于HBsAg陽(yáng)性的CHB臨床篩查[14]。Song等[15-16]利用三組橫截面隊(duì)列(隊(duì)列樣本來(lái)自地區(qū)醫(yī)院或采血機(jī)構(gòu)，包括535名既往感染者、56名隱匿性感染者、598名CHB患者)，應(yīng)用新型的雙抗原夾心ELISA檢測(cè)CHB不同自然病程階段的抗-HBc水平，結(jié)果顯示IT、IS、LR、ENH抗-HBc平均水平分別為：3.17 、4.39、3.29、4.12 log10IU/mL，且IT、IS、LR、ENH各階段HBV DNA及HBsAg水平分別為8.42 、6.92 、2.67 、5.32 log10IU/mL與4.84 、4.14 、2.88 、3.31 log10IU/mL(P<0.001)，可以觀(guān)察到IC、ENH等免疫激活狀態(tài)的病程階段有較高的抗-HBc水平，且將抗-HBc水平與其他指標(biāo)如ALT、AST、HBsAg、HBV DNA 、總膽紅素、白蛋白在各階段進(jìn)行比較，經(jīng)過(guò)多因素分析，發(fā)現(xiàn)ALT、AST在IC、ENH患者中顯示較高水平(P值均<0.05)，這也表明抗-HBc水平主要與機(jī)體的免疫狀態(tài)和肝炎活動(dòng)相關(guān)，而不是由HBV DNA或HBsAg水平所決定。另外，抗-HBc分泌效應(yīng)B細(xì)胞參與CHB免疫學(xué)應(yīng)答的過(guò)程，產(chǎn)生的肝細(xì)胞毒性效應(yīng)反映慢性乙型肝炎的嚴(yán)重程度，而抗-HBc在這個(gè)過(guò)程中又扮演著極為重要的角色。因此，盡管抗-HBc具體的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全明確[17]，但若抗-HBc水平高于基線(xiàn)，則往往能夠反映患者的免疫狀態(tài)。

三、抗-HBc定量水平與慢性乙型肝炎抗病毒治療應(yīng)答的相關(guān)性

(一)抗-HBc定量水平與聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)治療應(yīng)答的相關(guān)性利用敏感的、定量的、可預(yù)測(cè)抗病毒治療療效的指標(biāo)對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化診療分析是CHB研究的熱點(diǎn)。Yuan等在一項(xiàng)入組140名HBeAg陽(yáng)性且接受PEG-IFN治療的CHB患者中發(fā)現(xiàn)應(yīng)答較好的患者其抗-HBc水平均顯著高于基線(xiàn)，在P<0.05時(shí)，血清學(xué)應(yīng)答率(SR)、病毒學(xué)應(yīng)答率(VR)、聯(lián)合應(yīng)答率(CR)均較高。另外單因素相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)雖然高水平的ALT與SR、VR和CR也有一定關(guān)聯(lián)，但當(dāng)我們納入了抗-HBc變量，則無(wú)論哪種情況，ALT均被排除。這些結(jié)果表明，抗-HBc抗體水平比ALT在預(yù)測(cè)PEG-IFN療效應(yīng)答方面更有價(jià)值。對(duì)比分析示基線(xiàn)抗-HBc水平≥30 000 IU/mL的患者應(yīng)答效果更為顯著，治療過(guò)程中也能更好地抑制HBV DNA，且在PEG-IFN治療過(guò)程中能較好的控制乙肝疾病的進(jìn)展[18]。Yuen等[19]也認(rèn)為盡管基線(xiàn)ALT ≥5 ULN對(duì)于PFG-IFN抗病毒治療應(yīng)答是一個(gè)較好的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但探究一種更加敏感的臨床指標(biāo)是非常緊迫的。

在另一個(gè)核苷酸類(lèi)藥物(NUC)及IFN治療的小樣本隊(duì)列中，較高水平抗-HBc水平(NUC隊(duì)列≥29 000 IU/mL，IFN隊(duì)列≥9 000 IU/mL)的研究組有相對(duì)高的SR，在阿德福韋酯的隊(duì)列中，其靈敏度和特異性達(dá)到77.8%和77.5%，證實(shí)了治療前定量抗-HBc可以作為INF或者UNC的治療過(guò)程中HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)[20]。同時(shí)在另一項(xiàng)包括231例和560例分別以PEG-IFN或UNC為基礎(chǔ)治療長(zhǎng)達(dá)2年的患者，抗-HBc基線(xiàn)≥4.4 log10IU/mL、HBV DNA基線(xiàn)<9 log10拷貝/mL的HBeAg陽(yáng)性慢性患者在PEG-IFN、UNC兩種抗病毒藥物抗病毒治療時(shí)，血清學(xué)轉(zhuǎn)換率分別為65.8%和37.1%，說(shuō)明不論CHB抗病毒治療的藥物是PEG-IFN，還是UNC，亦或是兩種藥物的聯(lián)合治療，基線(xiàn)抗-HBc定量都是獨(dú)立預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的最好的指標(biāo)[21]。所以抗-HBc這一指標(biāo)在未來(lái)的診療過(guò)程中或?qū)⒖梢杂脕?lái)指導(dǎo)慢性乙型病毒性肝炎的優(yōu)化治療。

(二)抗-HBc定量水平與核苷(酸)類(lèi)似物治療應(yīng)答的相關(guān)性2014年Jian sun等在替比夫定優(yōu)化治療CHB臨床試驗(yàn)中也對(duì)抗-HBc進(jìn)行了定量檢測(cè)，抗-HBc水平>10 000 IU/mL聯(lián)合24周HBV DNA<300拷貝/mL可有效預(yù)測(cè)2年替比夫定治療CHB的療效應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)分析表明基線(xiàn)抗-HBc水平≥4.4 log10IU/mL是預(yù)測(cè)替比夫定治療下HBeAg血清轉(zhuǎn)換的獨(dú)立影響因素(多元隊(duì)列分析下其OR：1.994，95%CI：1.336～2.975，P=0.001)，相反，抗-HBc<4.4 log10IU/mL的患者僅僅只有14.5%(23/159)得到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。另外單因素分析提示，抗-HBc在隊(duì)列中有最高的OR值(OR：2.110)，相比HBV DNA(OR：1.930)及ALT(OR：1.514)，抗-HBc是較好的預(yù)測(cè)因子。且在單因素分析條件下發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NUC治療的患者其血清抗-HBc的水平下降的幅度顯著高于應(yīng)用PEG-INF治療的患者，其原因可能與NUC與PEG-INF抗病毒的作用機(jī)制不同有關(guān)，也有可能是抗-HBc分泌效應(yīng)B細(xì)胞的反應(yīng)頻率和數(shù)量不同有關(guān)。然而這些僅僅是臨床研究者們的假設(shè)，具體機(jī)制目前還不太明確[22]。這提示，應(yīng)用不同抗病毒藥物治療或一種抗病毒藥治療的不同時(shí)期其抗-HBc定量水平均有顯著差異，這極有可能反映著機(jī)體重要的免疫學(xué)變化，值得我們列入更多的對(duì)照變量以及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。

四、抗-HBc定量水平與人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)/HBV混合感染患者的診斷價(jià)值

泰國(guó)HIV/HBV混合感染的青少年約占HIV陽(yáng)性感染者的3.3%[23]，HIV感染的青少年多數(shù)沒(méi)有乙型肝炎保護(hù)性抗體，因此相關(guān)人員建議接種乙肝疫苗。另有一項(xiàng)土耳其地區(qū)的研究提示單項(xiàng)抗-HBc陽(yáng)性在HIV感染者中的檢出率為19.1%，HIV陽(yáng)性共感染HBV的情況顯著高于輸血感染HBV的患者，因此，相關(guān)部門(mén)也建議所有HIV感染者在開(kāi)始抗病毒治療前應(yīng)進(jìn)行抗-HBc篩查，以此來(lái)優(yōu)化艾滋病患者的診療[24]。這兩個(gè)報(bào)道表明，抗-HBc對(duì)HIV-HBV共感染具有一定實(shí)驗(yàn)室診療價(jià)值。

London艾滋病定點(diǎn)診療處收集了HIV陽(yáng)性患者的血清標(biāo)本，回顧性統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，抗-HBc陽(yáng)性率在艾滋病患者群體中非常高，達(dá)18.7%，Pallawela等[25]認(rèn)為盡管患者HBeAg陰性或者HBV DNA低于檢測(cè)下限，但是仍存在較高的HBV再激活的危險(xiǎn)。在近期的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，從614名HIV陽(yáng)性確診的獻(xiàn)血者和患者中抽取血液樣本，進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物的篩查，發(fā)現(xiàn)HIV陽(yáng)性個(gè)體罹患HBV的概率非常高，達(dá)到12.9%，故建議對(duì)新近診斷HIV陽(yáng)性/艾滋病的患者常規(guī)檢測(cè)HBV。而且發(fā)現(xiàn)如果僅僅用傳統(tǒng)的HBV血清學(xué)標(biāo)志物篩查，一些HIV-HBV共感染的患者仍不能得到明確診斷，HBV DNA雖然是一項(xiàng)比較好的檢測(cè)指標(biāo)，但是在HBeAg陰性患者中仍有約10%的共感染患者漏診[26]。因?yàn)樵陔[匿性HBV感染(OBI)的情況下，HBV DNA值往往低于檢測(cè)下限或無(wú)法檢出。此時(shí)，抗-HBc定量檢測(cè)就顯得尤為重要。已經(jīng)有不少研究表明，在OBI的隊(duì)列中，抗-HBc定量檢測(cè)有利于協(xié)助診斷HBV感染，采用新型的雙夾心免疫測(cè)定方法(動(dòng)態(tài)范圍在0.08～2.5 IU/mL的試劑盒)，將樣品在稀釋至1∶10至1∶100 000(增長(zhǎng)10倍)，如果抗-HBc水平>2.5 IU/mL，則表明存在HBV的感染，且在OBI中，抗-HBc水平在(1.02 ± 0.76) log10IU/mL的波動(dòng)范圍內(nèi)，故將抗-HBc水平 >7 820 IU/mL作為區(qū)分感染基礎(chǔ)上有無(wú)實(shí)質(zhì)性的肝臟炎癥的一個(gè)界限[27-28]，這有利于臨床工作者進(jìn)一步評(píng)估HIV感染基礎(chǔ)上的肝臟器官功能。且在免疫功能不佳的情況下，若HIV感染未接受高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療、患者年齡過(guò)大或免疫活性較低(此時(shí)抗-HBs低于檢測(cè)下限或無(wú)法檢測(cè)出)，HIV患者體內(nèi)單項(xiàng)抗-HBc陽(yáng)性可以預(yù)測(cè)HIV-HBV共感染[29]。

五、小結(jié)

盡管臨床上用于乙型病毒性肝炎診療的免疫生化指標(biāo)很多，但是靈敏度和特異性各異?？?HBc的臨床應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)在各項(xiàng)研究中得到證實(shí)，定量檢測(cè)抗-HBc不僅體現(xiàn)在反映慢性乙型病毒性肝炎自然病程方面，更體現(xiàn)在乙型肝炎病毒隱匿性感染的協(xié)助診斷、乙型病毒性肝炎抗病毒療效應(yīng)答的預(yù)測(cè)評(píng)估、以及HIV/HBV混合感染時(shí)檢測(cè)抗-HBc對(duì)HIV患者優(yōu)化診療等領(lǐng)域。雖然目前我們對(duì)抗-HBc陽(yáng)性指標(biāo)的意義尚未完全澄清，但可以清楚地認(rèn)識(shí)到抗-HBc定量分析對(duì)臨床診療已具有重要意義，隨著抗-HBc檢測(cè)方法學(xué)的不斷研究和發(fā)展，抗-HBc定量的臨床意義將會(huì)有更深入的認(rèn)識(shí)和闡明，臨床應(yīng)用也將得到更多的推廣和開(kāi)發(fā)。

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(本文編輯：張苗)

201508上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生中心肝炎一科

陳良，Email:chenliang6502@126.com

2016-04-26)