崔曉陽　馮春顏　朱彩云　張劉兵　周衛(wèi)

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血液分析儀新型熒光血小板計數(shù)法的基本性能評價

崔曉陽①深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 廣東 深圳 518109馮春顏①朱彩云①張劉兵①周衛(wèi)①

[摘要]目的：對XN3000血細胞分析流水線新型熒光血小板(PLT-F)計數(shù)法的基本性能進行評價。方法：對新型PLT-F計數(shù)的總重復性、精密度、攜帶污染率、線性稀釋、抗紅細胞碎片干擾以及與顯微鏡血小板(PLT-M)計數(shù)法的相關性等基本性能進行評估。同時進行鞘流電阻抗血小板(PLT-I)計數(shù)和光學血小板(PLT-O)檢測。結果：總重復性為1.40%，平均批內(nèi)精密度為1.36%，批間精密度為1.93%，攜帶污染率為0.00%～0.97%，均值為0.48%；在線性稀釋試驗中，測試值與理論值的相關系數(shù)(r)為0.999；PLT-F對紅細胞碎片有較強的抗干擾能力；PLT-F血小板計數(shù)值與PLT-M結果相關性良好，且低值血小板組(PLT＜100×109/L)，3種檢測方法的相關系數(shù)r值PLT-F＞PLT-O＞PLT-I。結論：PLT-F法精密度、準確度及線性較好，紅細胞碎片的抗干擾能力強。低值血小板計數(shù)與PLT-M相關性好，優(yōu)于PLT-I法。日常檢驗中使用PLT-I法計數(shù)血小板，若計數(shù)血小板異常減少或出現(xiàn)散點圖異常干擾時，必須用顯微鏡計數(shù)法或PLT-F法進行復查。

[關鍵詞]XN系列血液體液分析儀；血小板計數(shù)；性能評價

[First-author’s address] Department of Laboratory Medicine, People’s Hospital of New District Longhua Shenzhen, Shenzhen 518109, China.

XN3000血細胞分析流水線是由2臺XN10全自動血液體液分析儀與1臺SP10推片機組成。XN系列可定制化的全自動模塊式血液體液分析系統(tǒng)，可提供全血模式33個報告參數(shù)和31個研究參數(shù)，體液模式6個報告參數(shù)和12個研究參數(shù)。XN系列血液體液分析儀改進和新增了一系列檢測通道，包括用于測量白細胞分類(white cell differential channel，WDF)、測量有核白細胞(white cell nucleated channel，WNR)、嗜堿性細胞和紅細胞、測量異常和(或)未成熟細胞及白細胞前體(white cell precursor channel，WPC)和用于熒光血小板(fluorescent platelet channel，PLT-F)計數(shù)通道。在血小板計數(shù)方法上，XN系列同時保留上一代XE系列血細胞分析儀鞘流電阻抗(impedance，PLT-I)法和光學(optics，PLT-O)法。PLT-F法采用新型核酸熒光染料并增加了血小板計數(shù)粒子量，使得血小板計數(shù)的準確性和精度得到進一步提高。本研究采用PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種方法對血小板進行檢測，并對3種檢測方法的總重復性、精密度、線性范圍、攜帶污染、抗紅細胞碎片干擾以及與手工(manual，PLT-M)法相關性等性能進行評估[1]。

1　材料與方法

1.1 評價樣本

選取門急診患者、住院患者及體檢者送檢樣本120例，其中各種病因引起PLT減少血樣43例(100×109)/L。

1.2 儀器設備與試劑

采用日本Sysmex公司XN3000血細胞分析流水線，Olympus光學顯微鏡以及改良牛鮑計數(shù)板等。

Sysmex XN3000血細胞分析流水線試劑為原裝配套試劑、配套全血質(zhì)控品。血小板計數(shù)草酸銨法稀釋液按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版要求嚴格配制[2]。

1.3 檢測方法

1.3.1 總重復性試驗

隨機選擇高值、低值PLT樣本5例，中值樣本10例，在0 h、2 h和4 h時分別以PLT-I、PLT-O以及PLT-F方法進行測量[3]；所得數(shù)據(jù)計算總重復性變異系數(shù)CV(%)值為公式1：

式中n為重復測定次數(shù)(本試驗重復測定次數(shù)為3次)；u為樣本數(shù)；x-為均值。

1.3.2 批內(nèi)精密度試驗

隨機選取低值、中值及高值PLT樣本各1份，分別采用PLT-I、PLT-O以及PLT-F方法連續(xù)測量10次，分別計算標準差(SD)和變異系數(shù)CV(%)值。

1.3.3 批間精密度試驗

選擇省臨檢中心全血質(zhì)控品1例，每日隨常規(guī)樣本進行檢測，連續(xù)測量20 d，計算均值(x-)、SD和CV(%)值。

1.3.4 攜帶污染試驗

高值PLT樣本測量(H1、H2、H3)3次后，立即對低值樣本進行重復測量(L1、L2、L3)3次后，計算攜帶污染率采用公式2：

1.3.5 線性稀釋試驗

選擇PLT-M計數(shù)均值為482×109/L的血樣1例，再以稀釋度(5點法)計算值作為理論值，各稀釋度以PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種測試方法分別進行測量2次，取平均值與理論值作回歸分析，并以100×109/L為界分組進行相關性分析。

1.3.6 紅細胞碎片干擾試驗

取血離心后，取紅細胞層0.5 ml并加入蒸餾水破壞RBC，再次離心，用生理鹽水洗滌3次后，稀釋至5 ml，作為高濃度RBC碎片備用(實驗時加20 μl至試驗血樣中)；再取0.5 ml稀釋至5 mL作為低濃度RBC碎片備用(實驗時加20 μL至試驗血樣中)；對照管中加等量生理鹽水。最后，采用PLT-I、PLT-O和PLT-F測試方法進行測試，對照組和干擾組測試值作配對t檢驗。

1.3.7 相關性試驗

隨機抽取日常送檢樣本100例，采用PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種測試方法分別進行測量2次，PLT-M由2名經(jīng)驗豐富，具有中級職稱的檢驗師采用雙盲法進行計數(shù)，結果取2人均值。以PLT-M法為參考方法，PLT-I、PLT-O及PLT-F測定值分別與PLT-M法進行相關性和線性回歸分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件處理所有數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，測試值作配對t檢驗。

2　結果

2.1 總重復性試驗結果

采用PLT-I、PLT-O和PLT-F檢測的3種方法總重復性分別為1.46%、1.53%和1.40%。

2.2 批內(nèi)精密度結果

對低值、中值和高值3份不同濃度的血小板血樣進行檢測，3種方法在各水平上的血小板檢測精密度均符合儀器范圍(＜4%)，其結果見表1。

表1　PLT-I、PLT-O和PLT-F法批內(nèi)精密度結果(x-±s)

2.3 批間精密度結果

連續(xù)20 d，每日同一時間段測定全血質(zhì)控品，測試計算結果顯示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種檢測方法的批間精密度分別為2.56%、2.14%和1.93%，符合儀器精密度宣稱范圍(＜4%)。

2.4 攜帶污染試驗結果

進行10組血小板高、低值樣本攜帶污染實驗，檢測計算結果顯示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種檢測方法的平均攜帶污染率分別為0.78、0.60和0.48，符合儀器精密度宣稱范圍(＜1%)。

2.5 線性稀釋試驗

在PLT的3個濃度范圍內(nèi)，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種檢測方法檢測結果與理論值之間均有良好的相關性，其結果見表2。

表2　PLT-I、PLT-O和PLT-F法線性稀釋實驗

2.6 紅細胞碎片干擾試驗

本研究共進行10組高濃度和低濃度RBC碎片干擾實驗，3種檢測方法的RBC碎片干擾組分別與對照組進行配對t檢驗，其結果見表3。

表3　PLT-I、PLT-O和PLT-F檢測法紅細胞碎片干擾實驗(x-±s)

表3顯示，PLT-I方法高濃度和低濃度RBC碎片組測定值與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.56，t=3.06；P＜0.05)；而PLT-O和PLT-F則有較強的抗RBC碎片干擾能力。

2.7 與手工法PLT-M相關性評價

隨機選取100例血樣分別進行PLT-I、PLT-O和PLT-F儀器法以及PLT-M手工法計數(shù)，將3種檢測方法檢測結果分別與PLT-M法進行相關性和線性回歸分析。計數(shù)范圍＜100×109/L血樣記為低值血小板組，單獨進行回歸分析，結果見表4。

表4　3種檢測法與PLT-M手工法相關性評價(x-±s)

表4顯示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3種檢測方法與手工法相關性良好。低值血小板組的r值PLT-F＝0.986＞PLT-O＝0.973＞PLT-I＝0.912，表明血小板計數(shù)＜100×109/L時，PLT-F法優(yōu)于PLT-O法，這兩種方法明顯優(yōu)于PLT-I法。

3　討論

血小板由骨髓造血組織中的巨核細胞分化產(chǎn)生，具有維持血管內(nèi)皮完整性以及粘附、聚集、釋放、促凝和血管收縮等功能。血小板計數(shù)是臨床止血和凝血檢查最常用的篩查實驗之一，其對出血性疾病、放射治療及化療患者的療效監(jiān)測具有重要參考價值，也是血液系統(tǒng)疾病診斷的重要指標之一[4]。

目前，計數(shù)血小板的方法主要有3類：①顯微鏡目視計數(shù)法。采用草酸銨溶液作溶血稀釋液，在相差顯微鏡下肉眼直接計數(shù)血小板。該方法容易受到充池是否均勻、血小板在計數(shù)板上的分布等誤差因素影響，不同醫(yī)生之間計數(shù)變異系數(shù)可達10%～25%之間，已不適用于臨床工作的需求[5]；②流式細胞儀法。用熒光標記的血小板抗體CD61/CD41標記血小板，通過流式細胞儀檢測熒光計數(shù)。流式細胞儀法準確度和精密度極高，是國際血液學標準委員會(ICSH)推薦的參考方法，也是我國衛(wèi)生行業(yè)標準所規(guī)定的血小板計數(shù)的參考方法[6-7]。但該方法操作復雜、成本昂貴，因此難以在臨床上推廣使用，一般僅用于方法建立和儀器校準；③全自動血細胞分析儀法。因其具有測定速度快、重復性好及準確度高，能同時提供多項指標，是目前常規(guī)篩查PLT的主要方法[8]。

大部分全自動血細胞分析儀血小板計數(shù)原理是PLT-I，即在同一通道中通過顆粒大小來鑒別紅細胞與血小板，PLT-I法每次可檢測20～25萬個細胞，理論上具有較好的準確性和重復性。然而，PLT-I法僅通過顆粒體積大小來識別檢測血小板，易受非血小板顆粒(nonplatelet particles，NPPs)，如小紅細胞、紅細胞碎片、白細胞碎片、細菌和真菌以及免疫復合物等干擾[9]。為了提高血小板計數(shù)的準確性，增強對NPPs的辨識能力，國內(nèi)外各大血液分析儀廠商紛紛推出新的血小板計數(shù)方法，目前最具代表性的血小板光學計數(shù)法有[10]：①以西門子ADVIA?2120血液分析儀為代表的二維激光光散射計數(shù)法，此法主要檢測原理是當血小板經(jīng)過檢測區(qū)時，利用測量雙角度檢測器接受激光光束照射細胞而產(chǎn)生散射光信號，低角度散射光(2～3o)用于測量細胞體積；高角度(5～15o)散射光測量血小板細胞的折射指數(shù)。二維激光光散射計數(shù)法能有效的鑒別某些NPPs，如紅細胞碎片和小紅細胞與血小板體積相似，但折射指數(shù)較大，在血小板散點圖上分布在右下角，鬼影紅細胞由于折射指數(shù)較小，則分布在左上角。然而，二維激光光散射計數(shù)法仍是單純利用PLT的物理特性進行檢測，其檢測靈敏度和準確度均存在一定的局限[11]；②以Sysmex XE 2100血液分析儀為代表的熒光光學血小板計數(shù)法，此法采用聚次甲基等核酸染料對血小板的RNA/DNA進行染色，在前向散射光-熒光強度的二維散點圖上，對血小板進行檢測計數(shù)，同時還可以提供未成熟血小板比率(IPF)等參數(shù)。此法對上述NPPs具有較強的抗干擾能力，且對低值血小板計數(shù)(100×109/L)檢測的可靠性更高[12]。

XN系列是Sysmex公司最新推出的多參數(shù)全自動血液體液分析儀，采用了多種創(chuàng)新手段，增加了血細胞計數(shù)精度，改進了細胞分類和異常細胞識別報警能力[13]。PLT-F是XN系列血液體液分析儀新增的用于血小板計數(shù)的獨立檢測通道，應用了新型核酸熒光染料，使得血小板細胞在前向散射光和(或)熒光強度的二維散點圖上更容易與其他細胞區(qū)分開。同時PLT-F法采用的5倍粒子計數(shù)量也在一定程度上提高了低值血小板計數(shù)的精度[14-15]。

本研究中PLT-I、PLT-O和PLT-F檢測方法精密度指標：總重復性、批內(nèi)和批間精密度變異系數(shù)均＜4%，滿足儀器宣稱水平；3種檢測方法平均攜帶污染率分別為0.78、0.60和0.48，均＜1%，也符合廠商宣稱水平；線性稀釋實驗表明，在一定范圍內(nèi)，PLT-I、PLT-O和PLT-F檢測方法的3種檢測值與理論值之間有良好的相關性，在低值PLT時，PLT-O和PLT-F法與理論值之間擬合性較PLT-I法好；紅細胞碎片干擾實驗表明，PLT-O和PLT-F法具有相似的抗RBC碎片能力，明顯優(yōu)于PLT-I法；在相關性評價實驗中，低值血小板組(＜100×109/L)，3種檢測方法與手工法的相關系數(shù)rPLT-F＞rPLT-O＞rPLT-I，表明低值血小板計數(shù)時，PLT-F法優(yōu)于PLT-O法，這兩種方法明顯優(yōu)于PLT-I法[16-17]。

4　結語

本研究結果表明，PLT-F計數(shù)法基本性能優(yōu)良，能夠滿足臨床檢驗需求。線性稀釋實驗和相關性評價結果均表明，在進行低值血小板計數(shù)時，與PLT-I和PLT-O法相比，PLT-F法的準確性更高。雖然PLT-F法在血小板計數(shù)方面性能優(yōu)異，但由于其需要消耗額外的熒光染料，檢測成本高，檢測速度慢(68樣本/h)，并不適合日常臨床篩查。本研究在個性化定制XN3000流水線時，充分利用了其自動復檢功能，自定義復檢規(guī)則，將第一臺XN10設置為主檢測機型，采用CBC+DIFF模式(PLT-I法)進行大規(guī)模常規(guī)篩查，將第二臺XN10設置為復檢機型。當PLT檢測結果觸發(fā)相應復檢規(guī)則時，通過軌道自動將相應血樣導入第二臺XN10血液分析儀采用CBC+DIFF+PLT-F模式(PLT-F法)進行復查。通過2臺血細胞分析儀的合理搭配，可有效降低工作量，且能夠為臨床診斷和治療提供更準確的信息[18-19]。

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Research on performance evaluation of new fluorescence platelet count method of hematology analyzer/CUI Xiao-yang, FENG Chun-yan, ZHU Cai-yun, et al// China Medical Equipment,2016,13(1):70-74.

[Abstract]Objective: To evaluate the platelet (PLT) count performance of Sysmex XN 3000 automatic hematology analyzer. Methods: PLT was counted by Sysmex XN 3000 automatic hematology analyzer with electric impedance (PLT-I), optical (PLT-O) and fluorescence (PLT-F) method to test the precision, linear range, carryover and the red blood cell fragment interference. The count results of PLT-I, PLT-O and PLT-F were compared with those of microscopic count method (PLT-M) respectively. Results: The within batch precision of PLT-F was 1.36%and the between batch precision was 1.93%. The ranges of carryover ratio are from 0 to 0.97%with PLT-F, and the average carryover ratio was 0.48%. The correlation coefficient (r) was 0.999 in lower, medium and high value specimens. The result showed that the PLT-F method had great ability of anti-interference in RBC fragment interference experiment. There was significant correlation in the results between PLT-F and PLT-M, and the accuracy of PLT-F was higher especially in low PLT specimens group (rPLT-F>rPLT-O>rPLT-I). Conclusion: The measuring item is of high accuracy, good repeatability, quickness and anti- interference for platelet count. When specimens are hemolysis or the PLT count abnormalities, PLT-F or microscopic method are recommend to review the result.

[Key words]Automatic hematology analyzer; Platelet count; Performance evaluation

收稿日期：2015-03-18

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.01.022

[文章編號]1672-8270(2016)01-0070-05

[中圖分類號]R446.111

[文獻標識碼]A

作者簡介
崔曉陽,女,(1981- ),碩士，主管檢驗師。深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，從事血液學臨床檢驗工作。