段星娥 楊紅潤

【摘要】目的 分析云南省遺傳性耳聾分子基礎(chǔ)。方法 分析48例GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA直接測序法的異常結(jié)果。結(jié)果 GJB2基因發(fā)現(xiàn)4個突變位點，包括：79G>A、341A>G、109G>A和235delC，12sRNA發(fā)現(xiàn)三個突變位點，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，SLC26A4和GJB3基因均未見突變； 突變頻率最高的突變位點是GJB2 79G>A和12sRNA 1438 A>G，其次是GJB2 341A>G。結(jié)論 GJB2和12sRNA基因可能是云南省最常見的致聾基因，兩個基因的熱點突變與國內(nèi)其它地方報道的有差異。

【關(guān)鍵詞】遺傳性耳聾；測序； GJB2； SLC26A4； GJB3； 12srRNA

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2016）01-0012-03

耳聾是人類常見的遺傳病之一，每1000個兒童里 1.3-2.3名兒童受耳聾困擾，超過50%的兒童期耳聾為遺傳性耳聾，在遺傳性耳聾中70%以上為非綜合征耳聾[1]。研究表明中國人的大部分非綜合征性耳聾由幾個主要基因的突變引起[2]， 如GJB2、SLC26A4、12srRNA，在此基礎(chǔ)上商業(yè)公司開發(fā)出了高通量的基因芯片法檢測。然而耳聾基因突變有一定的地域和種群差異，云南是中國少數(shù)民族最多的省份，有關(guān)耳聾基因突變的分子生物學(xué)研究報道較少，我們利用直接測序法篩選中國人常見的4個耳聾候選基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA對48例兒童非綜合性耳聾做了分析。

一、資料與方法

1.1.病例資料

48例聽力受損兒童均來自云南省內(nèi)各醫(yī)院耳鼻咽喉科門診病例，其中漢族16例，回族9，彝族8例，白族8例，納西族4，傣族1例，其它2例，年齡1-14歲，平均年齡5.3歲，男8例，女9例。所有病例通過病史調(diào)查（包括家族史、耳聾史及耳毒性藥物的使用情況等）和聽力學(xué)檢測證實為非綜合性耳聾。聽力損失程度根據(jù)純聽力圖，分別計算雙耳氣導(dǎo)0.5KHz、1 KHz、2 KHz、4 KHz處的平均聽閾，按WH O 標準進行分類： 聽力正常：≤25dBHL；輕度聽力損失： 26～40 dBHL；中度聽力損失： 41～70 dBHL； 重度聽力損失： 71 ～90 dBHL；極重度聽力損失： >90 dBHL。所有患者家長均簽署知情同意。

1.2.研究方法

1.2.1.試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒及2*pcr-mix均購自Tiangen公司，測序試劑Bigdye3.1為美國AB公司產(chǎn)品，定性PCR儀為BIO-RAD C1000 型； 凝膠掃描儀為UVP EC3Imaging System； 電泳儀為Bio-Rad產(chǎn)品；遺傳分析儀AB3500型。

1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0設(shè)計引物，引物信息見表1，引物經(jīng)上海生工合，Page純化。

1.2.3.標本采集與基因組DNA提取

采集靜脈全血3ml，EDTA-K2抗凝，所有血樣用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為：PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，10pmol/μL引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板2 μL，加水至25 μL；PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94℃20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。

1.2.5.DNA測序

PCR 產(chǎn)物4μL 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外觀察為清晰明亮的目的擴增條帶（無雜帶），擴增片段用上、下游引物正反向分別測序。

二、研究結(jié)果

2.1測序結(jié)果突變類型

GJB2基因發(fā)現(xiàn)4個突變位點，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA發(fā)現(xiàn)三個突變位點，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，見圖1-5。SLC26A4和GJB3基因均未發(fā)現(xiàn)突變。

2.2. 突變基因型、臨床表型及突變頻率

48例測序發(fā)現(xiàn)最常見的突變12sRNA 1438 A>G，和GJB2基因79G>A，其突變頻率都達25.68%，其次是GJB2 341A>G，突變頻率為18.92%，發(fā)現(xiàn)1例GJB2 79G>A、341A>G和12sRNA 1438 A>G復(fù)合突變，見表2，3。

三、討論

隨著人類基因組計劃的實施和完成，耳聾致病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆也取得了很大的進展，遺傳性耳聾的致病基因及同一基因的突變位點在不同種族，甚至同一種族不同地區(qū)的人群中不盡相同，有很強的種族特異性。全國性耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查顯示我國感音神經(jīng)性聾患者由幾個主要基因主幾熱點突變引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G 、 IVS7-2A>G）、GJB3 基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我們設(shè)計合成的5對引物其PCR擴增片段包含了以上4個基因的熱點突變位點。GJB2 基因是最常見的致聾基因，高達21. 01%的耳聾患者攜帶該基因突變；其次是大前庭水管綜合征的責任基因SLC26A4 ，其在耳聾人群中的檢出率占15% 以上；另外，對氨基糖苷類抗生素異常敏感而至聾的12sRNA 1555A>G 和1494C>T檢出率分別3. 43% 和1. 03%。本文48例耳聾基因測序結(jié)果異常但臨床表型正常的有4例，為先證者的兄弟（或姐妹），實際臨床患有耳聾為42例，GJB2基因檢出率為69.05%（29/42）；12sRNA檢測出率為52.38%（12/22）。這和全國的調(diào)查結(jié)果有差異，這可能和云南特有民族結(jié)構(gòu)的分布有關(guān)，也有可能本文收集病例數(shù)較少，有些病例是同一個家系內(nèi)的樣本有關(guān)。

本文檢出的GJB2 79G>A和341 A>G導(dǎo)致編碼的第27 位和114位分別從纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岷凸劝彼徂D(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?，盡管有6例GJB2 79G>A和341 A>G臨床表現(xiàn)為正常，但它和其它耳聾基因突變組成復(fù)合突變時臨床表現(xiàn)中度或輕度聽力損失，表明攜帶GJB2 79G>A和341 A>G突變對遺傳性非綜合征性耳聾的發(fā)生具有密切的相關(guān)性，對于非綜合征性耳聾發(fā)病有較高風險，這與文獻報道一致。

本文發(fā)現(xiàn)的GJB2 109G>A，12sRNA 1382A>C國內(nèi)文獻報道不明。GJB2 109G>A為突變雜合子，導(dǎo)致第37位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，臨床上表現(xiàn)中度聽力損失，提示該位點突變?yōu)樵摬±年P(guān)鍵因素，可能是云南民族耳聾致病基因特有的突變位點，其致病機制需要更進一步研究。12sRNA 1382A>C檢出2例突變，其中1例與12sRNA 1555A>G組合成復(fù)合突變，臨床上表現(xiàn)重度耳聾，2例均有氨基糖苷類抗生素用藥史，提示該位點亦是導(dǎo)致藥物性耳聾的作用靶點。

參考文獻：

[1] H V Toriello， W Reardon， R J Gorlin. Hereditary hearing loss and its syndromes[M]. Oxford University Press，2004. 67-69.

[2]戴樸，劉于飛，等。18 個省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究-GJB2 235delC 和線粒體DNA 12SrRNA A1555G 突變篩查報告[J]。中華耳科學(xué)雜志，2006，1（4）：1-5。

[3]李琦，戴樸，黃德亮，等。SLC26A4 基因IVS7-2A>G 突變在中國不同地區(qū)和民族重度感音性聾患者中分布頻率的觀察[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，42（12）：893-897.

[4] Reardon W. Genetic Deafness. J Med Genet. 1992， 29：521-526