熊結標

摘 要：CBF1基因的擴增是研究植物抗旱基因的前期工作。本研究用Trizol試劑法提取模式植物擬南芥葉片的總RNA，經(jīng)過反轉錄進行PCR擴增，將產(chǎn)物DNA回收后，連接PCR片段與T載體，電擊轉化入E. coli大腸桿菌感受態(tài)細胞；涂平板長出菌落，挑取半個白斑菌落電泳鑒定轉化子；鑒定完成后提取質(zhì)粒，用雙酶切法進行鑒定，結果表明獲得CBF1基因。

關鍵詞：擬南芥 RNA 抗旱基因 CBF1

擬南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，兩年生草本，高7厘米～40厘米，廣泛用于植物遺傳學、發(fā)育生物學等研究，已成為一種典型的模式植物。其原因主要基于該植物具有以下特點：植株個體?。?平方厘米可種植好幾棵）、生長周期快（從發(fā)芽到開花不超過6周）、種子多（每株每代可產(chǎn)生數(shù)千粒種子）、生命力強（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)），其基因組是目前已知植物基因組中最小的；同時，擬南芥屬于自花授粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能缺陷型的植株。因此，其被科學家譽為“植物中的果蠅”。

1. CBF基因功能及特性

CBF轉錄激活因子是一類受低溫特異誘導的反式作用因子，它們能與CRT/DRE（C-repeat/dehydration-responsive element）DNA調(diào)控元件特異結合，促進啟動子中含有這一調(diào)控元件的多個冷誘導和脫水誘導基因的表達，從而激活植物體內(nèi)的多種耐逆機制。擬南芥CBF1轉錄激活因子能調(diào)控一組抗干旱、抗低溫基因的表達，更有效地提高植物抗干旱、抗低溫的能力。對冷馴化過程中基因表達差異的認識，使抗凍基因（COR）的克隆及其功能的分析成為研究冷馴化過程的主要目標，在擬南芥和其他抗凍植物中分離出許多COR基因，這些基因對植物抗凍有非常重要的作用。在擬南芥COR調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)CBF轉錄因子的基因家族，其中CBF1能調(diào)控一組COR基因的表達。近年來，在冷敏植物如番茄和玉米中發(fā)現(xiàn)了CBF類似基因，擬南芥CBF1基因在轉基因番茄和小麥中的過量表達提高了植株的抗寒和抗旱性。這一研究結果展示了擬南芥CBF1類似基因的應用可能為冷敏植物抗寒和抗旱性的品種改良提供一條新的途徑。

2.材料與方法

2.1材料

2.1.1菌株、植物材料和載體

擬南芥Columbia（At）、E.coli JM109為本實驗室保存，pMD18-T Vector購于TaKaRa公司。

2.1.2主要試劑

樹脂型TM PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于賽百盛公司。

Trizol試劑為Invotrigen公司產(chǎn)品，2×Pfu PCR MasterMix購于北京天為時代生物技術公司，DEPC為Sigma公司產(chǎn)品，MLV反轉錄酶、T4-DNA連接酶為BioLab公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑都購于各生物技術公司。

2.1.3緩沖液配制

焦炭酸二乙酯（DEPC）處理水：向蒸餾水中加入DEPC至終濃度為0.1%，攪拌至少12h，然后121℃滅菌30 min。

溶液Ⅰ：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml；高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.1 mol/L NaOH，1%SDS。

溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，過濾滅菌，保存在4℃。

2.2試驗方法

2.2.1擬南芥總RNA的提取

用Trizol一步法提取擬南芥葉片的總RNA。為防止RNA的降解，提取RNA所用的器具均用0.1%DEPC室溫下浸泡12h以上，然后121℃高溫處理。

2.2.1.1取適量擬南芥葉片（經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱）置于研缽內(nèi)，加液氮，研磨成粉末；

2.2.1.2取加有1ml Trizol試劑的1.5ml離心管，將50mg～100mg研磨好的樣品加入離心管，混勻，室溫放置5分鐘后，4℃，12000rpm/min離心5分鐘；

2.2.1.3將上清液轉入新離心管中，加200ul氯仿，振蕩混勻后，室溫放置15分鐘，4℃，12000g離心15分鐘；

2.2.1.4小心吸取上層水至另一離心管中，加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘～10分鐘。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清，RNA沉于管底；

2.2.1.5加1ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管。4℃，8000g離心5分鐘，盡量棄上清；

2.2.1.6室溫晾干或真空干燥5分鐘～10分鐘，用50μl無RNA酶水溶解RNA樣品，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收法確定總RNA的純度、濃度和完整性，立刻進行下一步的實驗或-80℃冰箱保存。

2.2.2反轉錄

輕輕混合，短暫離心，25℃保溫5min，42℃保溫60min，95℃處理5min，終止該反應，離心10s～20s，將其放置在37℃下，加入1μL RNAase，輕輕混勻，37℃反應30min，反應結束后，將樣品短暫離心，立刻進行下一步的實驗或-20℃冰箱保存。

2.2.3引物的設計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查找擬南芥中的一個DREB類轉錄因子基因CBF1，利用該cDNA基因序列設計引物CBF1up和CBF1down，從擬南芥cDNA中擴增CBF1類轉錄因子基因。

CBF1up：5'-ATGAACTCATTTTCAGCTTTTTCTG-3'

CBF1down：5'- TTAGTAACTCCAAAGCGACACG -3'

2.2.4PCR片段的擴增

PCR反應體系20 L：2×Pfu PCR MasterMix 10μl，dNTP（10 mmol/L） 1μl，cDNA模板1μl，CBF1up （10μmol/L）和 CBF1down （10μmol/L）各1μl，ddH2O補至 20 L。擴增程序：94℃預變性2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1.5min，30個循環(huán)；然后72℃延伸10min，擴增產(chǎn)物進行電泳檢測（1%瓊脂糖，80V，20分鐘）。

2.2.5 DNA片段的回收

使用樹脂型TM PCR產(chǎn)物純化試劑盒（賽百盛公司） 回收PCR產(chǎn)物，具體操作過程參照使用說明書進行。得到目的片段后，取4μl電泳（0.8%瓊脂糖，120V，10分鐘）檢測并定量測定。

2.2.6PCR片段與T載體的連接

配制A反應混合物（使用前臨時配制）：回收PCR片段33μl，10×PCR Buffer 4μl，dNTP（10mmol/L） 2μl，Tag酶1μl，總體積為40μl；把加A反應混合物72℃孵育10 min，加120μl無水乙醇和4μl乙酸鈉，混勻后-20℃沉淀20min，13000rpm離心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm離心5min。沉淀真空干燥10min后用4.5μL無菌水溶解，用于與pMD18-T載體連接。

按照TaKaRa的pMD18-T Vector說明配制連接反應混合物：DNA片段4.5μl，pMD18-T載體0.5μl，Solution I 5μl，總體積為10μl。把連接反應混合物在16℃保溫12-16小時。然后加1μl乙酸鈉（1/10體積）和33μL無水乙醇（3倍體積），-20℃沉淀20min，13000rpm離心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm離心5min。沉淀真空干燥10min后用5μL無菌水溶解。

2.2.7轉化

把Eppendorf管和電轉化杯預冷備用，于冰上凍融-70℃保存的感受態(tài)細胞，取2.5μL重組載體加入到40μL的感受態(tài)細胞中混勻，冰浴1min；將細胞和DNA混合液轉到電轉化杯中，并將液體敲至杯底。把小杯放入電轉儀的小盒中，電擊；取出小杯，迅速加入1mL LB培養(yǎng)基，重懸細胞。把細胞轉至滅菌的離心管中，37℃輕柔振蕩1小時，取電擊轉化培養(yǎng)液500μL，往離心管中加入40μl X-gal（20 mg/ml）和4μl IPTG（200 mg/ml），混勻后，涂平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

2.2.8鑒定轉化子

從平板上挑取半個白斑菌落，進行PCR鑒定，PCR反應體系為：10×PCR Buffer 2μL，dNTP（10 mmol/L） 1μL，CBF1up （10 μmol/L）和CBF1down（10 μmol/L）各1μl，Taq酶1μl，再挑入半個白斑菌落，用ddH2O補齊到20μL。

擴增程序：94℃預變性2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，32個循環(huán)；然后72℃延伸10min，擴增產(chǎn)物進行電泳檢測（1%瓊脂糖，80V，20分鐘）。

2.2.9質(zhì)粒DNA的大量提取

2.2.9.1取一管-70℃保存的大腸桿菌（含已轉化目的片段的質(zhì)粒），接種50mL LB培養(yǎng)基（含100μg/mL Amp），37℃ 260r振蕩過夜。

2.2.9.2取過夜培養(yǎng)物，5000r，4℃離心3min。

2.2.9.3棄上清，倒置離心管于吸水紙上，吸去殘余的液體。

2.2.9.4用3mL溶液I重懸沉淀，在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，使沉淀充分懸浮。

2.2.9.5加入6mL新鮮配制的溶液II，輕輕顛倒混勻，冰上放置3min。

2.2.9.6加入4.5mL溶液III，輕輕顛倒混勻，冰上放置5min。

2.2.9.713000r，4℃離心10min，移出上清，用擦鏡紙過濾。

2.2.9.8上清中加入0.6-1倍體積的異丙醇，冰上放置10min，13000r，4℃離心10min。

2.2.9.9棄上清，70%乙醇小心漂洗沉淀，稍離心后傾去乙醇，將沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.10在干燥后的離心管中，每管加入500mL TE，用槍把沉淀打散，移入Eppendorf管中，加入10μL RNase，37℃保溫15min。

2.2.9.11每管加入500μL Tris飽和酚，顛倒混勻，14000r離心3min。

2.2.9.12小心將上層水相移至另一無菌Eppendorf管中，加入500μL 酚∶氯仿，顛倒混勻，14000r離心2min。

2.2.9.13小心將上層水相移至另一無菌Eppendorf管中，加入500μL 氯仿，顛倒混勻，14000r離心15min。

2.2.9.14取上清，加入等體積13.3% PEG8000，冰上放置15min，14000r離心15min。

2.2.9.15棄上清，沉淀用500μL 70%乙醇小心漂洗（盡量不使沉淀漂起來），離心3min。棄去乙醇，沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.16用50μL無菌水或TE液溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆茫蛎盖须娪緳z測。

2.2.10雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和 Pst I雙酶切處理。酶切體系為：酶切緩沖液2.5μl，PCR產(chǎn)物或載體3.0μl，EcoR I（10U/μl） 1.0μl，Pst I（10U/μl） 1.0μl，無菌水17.5μl，總體積為25μl。37℃孵育1h，瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

3.結果與分析

3.1 RT-PCR擴增CBF1基因

以總RNA為模板，通過MLV反轉錄酶合成cDNA的一鏈，再以此為模板，采用CBF1up和CBF1down為引物，擴增激活蛋白cDNA基因，瓊脂糖凝膠電泳后，得到一條約1Kb大小的片斷，結果如圖1。

3.2擴增片段與T載體連接

把片斷回收，加A后與pMD18-T載體連接后，重組質(zhì)粒命名為pT-CBF1，并轉化大腸桿菌JM109后，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，根據(jù)T載體上的多克隆位點序列，選用EcoR I和 Pst I進行酶切，瓊脂糖電泳，電泳結果如圖2：

3.3序列分析

分析序列并利用軟件DNAMAN翻譯相應蛋白質(zhì)，得到該基因A、C、G、T數(shù)量分別是162、138、186、156，GC%為50.47%。

對翻譯所得的蛋白序列進行分析，蛋白長度為213個氨基酸，分子量為23811.4，各氨基酸組成的分析見上表1。

4.總結與討論

本文根據(jù)Tran 等報道的擬南芥中CBF1基因序列設計引物，擴增基因，并連接到克隆載體上，下一步進行原核表達，利用表達產(chǎn)物制備多克隆抗體，用以確定高羊茅、狗牙根、結縷草和馬蹄金等抗旱性強的植物中是否含有DREB類轉錄因子，然后從所篩選的植物中獲得新的DREB類轉錄因子基因，并對該基因進行序列分析、功能預測及其表達研究，同時構建DREB類基因的植物表達載體，為進一步利用DREB類轉錄因子基因進行其他草坪草的遺傳轉化，為培育抗旱草坪草品種奠定基礎。

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