馬學(xué)翔, 董　嚴(yán), 韓　飛, 李小娜, 時(shí)小燕, 陳洪強(qiáng), 郝翔麟, 劉晉祎

(第三軍醫(yī)大學(xué) 毒理學(xué)研究所, 重慶, 400038)

?

Sox30基因在大鼠睪丸發(fā)育中的表達(dá)與甲基化分析

馬學(xué)翔, 董嚴(yán), 韓飛, 李小娜, 時(shí)小燕, 陳洪強(qiáng), 郝翔麟, 劉晉祎

(第三軍醫(yī)大學(xué) 毒理學(xué)研究所, 重慶, 400038)

摘要:目的分析Sox30基因在大鼠胚胎發(fā)育以及性腺中的表達(dá)和甲基化情況。方法取大鼠胚胎發(fā)育不同時(shí)期組織、出生后至73 d雌雄大鼠性腺和成年不同組織，利用RT-PCR分析該基因的表達(dá)情況。利用亞硫酸氫鈉處理后測(cè)序法 (BSP)分析Sox30基因甲基化發(fā)生情況。結(jié)果Sox30基因在大鼠胚胎發(fā)育10.5 d就開始表達(dá)；出生后Sos30主要在睪丸中表達(dá)，且表達(dá)逐漸增加，而在卵巢、子宮中不表達(dá)；成年大鼠的腦、心、肝、腎、脾、胰、肺、垂體、腸、肌肉、海馬等組織中該基因低表達(dá)或者不表達(dá)。Sox30表達(dá)受甲基化調(diào)控，低表達(dá)或者不表達(dá)組織中該基因明顯高甲基化。結(jié)論Sox30基因表達(dá)受到其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控，成年大鼠中該基因僅在睪丸中高表達(dá)，表明該基因與雄性性別發(fā)育以及睪丸的功能維持有關(guān)。

關(guān)鍵詞:Sox30基因; DNA甲基化; 睪丸

SOX 家族是一類SRY相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族, 該家族的所有成員均含有一個(gè)HMG-box DNA 結(jié)合域, 因此屬于核轉(zhuǎn)錄因子蛋白。該家族成員主要參與一些細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育過(guò)程中的一些調(diào)控，尤其是在早期發(fā)育中有一定的組織特異性，因此被認(rèn)為是目標(biāo)特異性的轉(zhuǎn)錄因子蛋白[1]。

Sox30基因是Sox基因家族H亞族的唯一成員，首先從小鼠和人類中分離得到，基因表達(dá)分析結(jié)果[2]顯示，Sox30基因表達(dá)于雄性性腺的生殖細(xì)胞。作者前期研究結(jié)果揭示，Sox30是一個(gè)與睪丸發(fā)育密切相關(guān)的重要基因，而且其表達(dá)模式受其DNA甲基化變化的調(diào)控[3]。然而，Sox30基因是否和大鼠睪丸發(fā)育相關(guān)以及其表達(dá)模式與其DNA甲基化是否存在聯(lián)系還不得而知。

本研究對(duì)成年大鼠各組織和發(fā)育各階段的睪丸中Sox30基因的表達(dá)和DNA甲基化進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究結(jié)果顯示，Sox30只在成年大鼠的睪丸組織中大量表達(dá)，而在其他組織中不表達(dá)或者表達(dá)量很低；Sox30基因在睪丸中隨著發(fā)育其表達(dá)量持續(xù)升高，40 d后達(dá)到峰值并維持較高表達(dá)量；Sox30在成年大鼠各組織和發(fā)育各階段睪丸中的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控。因此，Sox30是一個(gè)受DNA甲基化調(diào)控且與大鼠睪丸發(fā)育或者功能維持密切相關(guān)的重要基因。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及取材

大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院，動(dòng)物在恒定溫度(25 ℃)、50%～60%相對(duì)濕度、每天12 h光照/黑暗、水和食物自由采食條件下飼養(yǎng)。將性成熟的雄性大鼠和雌性大鼠于下午合籠，陰道涂片檢查有白色陰栓時(shí)，雌性大鼠受孕成功，即為孕期1 d。頸椎脫臼法處死大鼠后用常規(guī)方法取大鼠的胚胎、睪丸及其他組織器官，所有組織器官凍存于液氮備用。

1.2基因組DNA和總RNA提取

DNA提取參照Promega公司DNA純化提取試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行，DNA樣品定量后保存在-20 ℃?zhèn)溆?。用TRIzol法分別提取組織樣品總RNA，RNA定量后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3Sox30亞硫酸氫測(cè)序PCR(BSP)測(cè)序

DNA樣品使用EZ DNA甲基化修飾試劑盒(Zymo Research，D5005)進(jìn)行修飾，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BSP擴(kuò)增引物序列為: Primer1: 5-AAGGTTTAAAAG ATTTTAATAGATT-3; Primer2: 5-TCTAAACCTTATTCTTAATTACCCC-3; 取1 μL修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增條件: 95 ℃ 3 min，95℃ 40 s, 66℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 10個(gè)循環(huán)，95 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán), 72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳證實(shí)。將瓊脂糖膠電泳上目的DNA片段切下，按照Omega膠回收試劑盒純化目的片段，并連接入pGEM-T Easy Vector，然后轉(zhuǎn)染DH5α細(xì)菌；參照Omega質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4RT-PCR及核酸凝膠電泳分析

RNA樣品用promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒A5001分兩步法獲得cDNA。取模板cDNA 1 μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)，加入Sox30基因上、下游引物各1 μL，β-actin內(nèi)參基因上、下游引物各1 μL，加入TaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為Sox30-F: 5-TTTTTTTTATGGAGAGAGTTAGGT-3; Sox30-R: 5-AAAACAACAACA ACACCTATTCC-3; β-Actin-F: 5-GGAGATTACTGCTGGCTCCTA-3; β-Actin-R: 5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。擴(kuò)增條件: 95℃ 3 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結(jié)果

2.1Sox30基因只在成年大鼠睪丸組織中高表達(dá)

為了確定Sox30在成年大鼠各組織中的表達(dá)情況，作者提取了成年大鼠的16種器官組織的RNA，并進(jìn)行RT-PCR及核酸凝膠電泳分析。結(jié)果表明，在成年大鼠中，Sox30僅在睪丸中高表達(dá)，在血液中有少量表達(dá)，而在卵巢、子宮、附睪、腦、心、肝、腎、脾、胰、肺、垂體、腸、肌肉、海馬中呈現(xiàn)不表達(dá)或極少表達(dá)(圖1)。

圖1 Sox30基因在成年大鼠各種組織中的表達(dá)分析

2.2Sox30基因隨睪丸發(fā)育表達(dá)逐漸增強(qiáng)

作者隨后對(duì)整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中性腺組織Sox30的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在E8.5(8.5 d胚胎)，E10.5，E12.5，E15.5和E19.5，Sox30處于低量表達(dá)狀態(tài)；在1D(產(chǎn)后1 d)，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的卵巢中Sox30處于低量表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)；而在1D，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的睪丸中Sox30處于高表達(dá)狀態(tài)，而且隨著發(fā)育的進(jìn)行其表達(dá)量持續(xù)性升高直到大鼠成年，表明Sox30與大鼠雄性性腺的發(fā)育和功能密切相關(guān)(圖2)。

(E:胚胎期,d:日齡,♂雄性,♀雌性)圖2 Sox30基因在大鼠發(fā)育不同階段的性腺中的表達(dá)分析

2.3Sox30在成年大鼠各組織的表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控

為了證明Sox30基因在大鼠各組織中的表達(dá)與否和其DNA甲基化有關(guān)，作者通過(guò)BSP直接測(cè)序的方法對(duì)成年大鼠中典型一對(duì)組織睪丸和卵巢及胚胎時(shí)期性腺組織的Sox30基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sox30在胚胎時(shí)期的性腺組織中一直呈高甲基化狀態(tài)，這與之前所測(cè)得的Sox30的表達(dá)水平吻合。Sox30在大鼠睪丸組織中甲基化程度隨著發(fā)育睪丸的發(fā)育程度而降低，在大鼠成熟時(shí)達(dá)到最低(73 d); 而在卵巢組織發(fā)育過(guò)程中卻呈現(xiàn)持續(xù)高甲基化。該結(jié)果表明，Sox30基因在成年大鼠各組織中的表達(dá)受到DNA甲基化的調(diào)控(圖3)。

3討論

人和小鼠的不同細(xì)胞和組織器官中的SOX家族表達(dá)研究顯示，該基因表達(dá)具有組織和時(shí)間特異性，其胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)和突變分析研究還顯示，該基因在神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎發(fā)育過(guò)程中起到很重要的作用，因此SOX 基因家族成員的研究對(duì)于揭示性別決定的分子機(jī)制、參與胚胎發(fā)育的基因的調(diào)控等都有十分重要的意義[4-6]。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)，Sox30基因在成年小鼠中，僅表達(dá)于睪丸組織，推測(cè)其可能與雄性發(fā)育和睪丸正常功能有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)這種推測(cè)，作者分析了該基因在大鼠發(fā)育過(guò)程及成年不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn), Sox30基因在成年大鼠中除睪丸外，其他組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)。Sox30基因在大鼠胚胎發(fā)育的第10.5～12.5天有一定的表達(dá)，而這一時(shí)間段恰好是性別決定的關(guān)鍵時(shí)期，結(jié)合后期Sox30在睪丸中表達(dá)一直上調(diào)到成年個(gè)體表達(dá)達(dá)到最高值的數(shù)據(jù)，作者不難推測(cè)Sox30基因可能在胚胎發(fā)育早期參與了雄性性別的決定，而成年個(gè)體中則參與了睪丸功能的正常執(zhí)行。

(實(shí)心圓,表示該CpG位點(diǎn)甲基化;空心圓,表示該位點(diǎn)未甲基化)圖3 Sox30基因在成年大鼠組織和發(fā)育不同階段性腺組織DNA甲基化分析

大量的研究[7]表明，DNA甲基化在發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。作者前期的相關(guān)研究也表明，不管是在小鼠胚胎發(fā)育和成年組織中，Sox30基因表達(dá)均受甲基化調(diào)控。作者分析了大鼠胚胎不同時(shí)期及成年組織中Sox30基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況，發(fā)現(xiàn)睪丸中Sox30呈低甲基化

或非甲基化狀態(tài)，且甲基化程度隨著睪丸的成熟而降低；在胚胎發(fā)育早期、卵巢、子宮和成年其它組織中Sox30呈高甲基化狀態(tài)，這都提示Sox30啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的調(diào)控參與了維持睪丸的正常功能。有一點(diǎn)值得注意的是，在胚胎發(fā)育早期，Sox30有一定的表達(dá)，但是甲基化分析發(fā)現(xiàn)其高甲基化，這可能是由于早期胚胎中，多數(shù)細(xì)胞中該基因不表達(dá)，而僅有雄性生殖器官發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞中該基因高表達(dá)，這一部分細(xì)胞比較少，因此甲基化分析時(shí)檢測(cè)出的5個(gè)樣本均為高甲基化。

總之，在成年大鼠的各個(gè)組織器官及胚胎發(fā)育過(guò)程中，Sox30基因的表達(dá)受其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控，Sox30的高表達(dá)于成年大鼠睪丸，說(shuō)明其可能與睪丸的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)相關(guān)，是一個(gè)值得深入研究的基因。

參考文獻(xiàn)

[1]Jiang T, Hou CC, She ZY, et al. The SOX gene family: function and regulation in testis determination and male fertility maintenance[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(3): 2187. doi: 10. 1007/s11033-012-2279-3.

[2]Osaki E1, Nishina Y, Inazawa J, et al. Identification of a novel Sry-related gene and its germ cell-specific expression[J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(12): 2503.

[3]Han F, Dong Y, Liu W, et al. Epigenetic regulation of Sox30 is associated with testis development in mice[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e97203.

[4]Koopman P, Munsterberg A, Capel B. Expression of a candidate sex determining gene cloning mouse testis differentiation[J]. Nature, 1990, 348: 140.

[5]Shiota K, Yanagimachi R. Epigenetics by DNA methylation for development of normal and cloned animals[J]. Differentiation, 2002, 69: 162.

[6]常重杰, 杜啟艷, 邵紅偉. Sox基因家族研究的新進(jìn)展[J]. 遺傳, 2002(4): 470.

[7]Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development[J]. Science, 2001, 293(5532): 1089.

Study on DNA methylation and expression of Sox30 in the development of rat testis

MA Xuexiang, DONG Yan, HAN Fei, LI Xiaona, SHI Xiaoyan,CHEN Hongqiang, HAO Xianglin, LIU Jinyi

(InstituteofToxicology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400038)

ABSTRACT：ObjectiveTo analyze DNA methylation and expression of Sox30 in embryonic development and sex gland of rats．MethodsThe rat embryos from E8.5 to E19.5, tissues of main organ and sex gland in rats from birth to 73 days were collected．The DNA methylation and expression of Sox30 gene were detected by sodium bisulfite DNA sequencing (BSP) and RT-PCR．ResultsSox30 expression was able to detect in embryos at 10.5 days．The expression of Sox30 increased in the rat testis from birth to early adulthood, while it was not observed in ovary and uterus．Sox30 was low expression or non-expression in ovary, heart, brain, liver, kidney, spleen, pancreas, muscle, intestine, pituitary gland, blood and hippocampus of adult rats．Sox30 expression was regulated by methylation, and methylation of Sox30 was highly expressed in tissues with low expression or non-expression．ConclusionThe tissue-specific expression of Sox30 is associated with its methylation in rats．The stage-specific expression of Sox30 is correlated with its methylation and plays an important role in testis development and gonad function．

KEYWORDS:Sox30 gene；DNA methylation；testis

通信作者:劉晉祎

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81172714)

收稿日期:2015-08-05

中圖分類號(hào):R 339.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)01-005-03

DOI:10.7619/jcmp.201601002