【作 者】陳信元，張芷菁

上海市醫(yī)療器械檢測所，上海市，201318

CellSearch系統(tǒng)對細(xì)胞檢出率和線性度性能檢測方法的研究

【作 者】陳信元，張芷菁

上海市醫(yī)療器械檢測所，上海市，201318

該文對CellSearch系統(tǒng)在細(xì)胞檢出率和線性度性能檢測方法進行研究，從而分析出適應(yīng)CellSearch系統(tǒng)特征的準(zhǔn)確合理的檢測方法。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞檢出率；線性度；檢測方法

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康，而轉(zhuǎn)移是腫瘤患者最主要的死因。腫瘤的早期診斷對于患者的治療至關(guān)重要[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的正確檢測在腫瘤的診斷療效和預(yù)后判斷方面具有相當(dāng)重要的意義。

在原發(fā)腫瘤形成和生長的早期，部分細(xì)胞會從原發(fā)灶脫落并進入血液循環(huán)，這些高度異質(zhì)性的細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs），可能是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一種標(biāo)記。近年來，隨著敏感分子技術(shù)的發(fā)展，使得分離、計數(shù)外周血CTCs成為可能。在疾病早期階段，CTCs可能有助于良、惡性腫瘤的鑒別，轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測和判斷?，F(xiàn)有的CTCs分離、檢測技術(shù)方法較多，各有利弊。富集方法通常是基于CTCs的物理性質(zhì)（密度和大小）或免疫磁性，包括梯度離心法、過濾法、免疫磁性分選法等。檢測方法包括免疫學(xué)技術(shù)、基于RT-PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）技術(shù)和CTCs芯片技術(shù)等[2]。其中，免疫磁性分選法是目前最常用的CTCs富集方法，也是CellSearch系統(tǒng)所采用的方法。其主要步驟包括：上皮細(xì)胞黏附因子（Epithelial Cells Adhesion Molecule, EpCAM）抗體磁珠用于捕獲CTCs，細(xì)胞內(nèi)角質(zhì)蛋白熒光抗體（CK-PE）識別上皮細(xì)胞，白細(xì)胞熒光抗體（CD45-APC）識別白細(xì)胞，DAPI熒光核染料用于生成細(xì)胞圖像。本文對CellSearch 系統(tǒng)在細(xì)胞檢出率和線性度性能檢測方法進行研究，使其在今后的儀器上市前的檢測以及臨床中的普適性有借鑒意義。

1 CellSearch 系統(tǒng)的組成

CellSearch 系統(tǒng)由Autoprep系統(tǒng)、Analyzer系統(tǒng)、Cellsave儲存管以及配套的試劑組成。Autoprep系統(tǒng)是一種自動化樣本處理器，結(jié)合CTCs專用檢測試劑盒用于分離得到生物體液或全血中的罕見的已富集的樣本。Analyzer系統(tǒng)是一種半自動熒光光學(xué)系統(tǒng)，可自動對分選的CTCs進行拍照、分析和計數(shù)，以圖庫形式呈現(xiàn)備選的熒光檢測圖像，便于檢測者進行最終分類判讀。Cellsave儲存管內(nèi)裝有特定的細(xì)胞保護劑，能夠幫助提高分析結(jié)果的可再現(xiàn)性和可靠性，同時確保CTCs能夠在室溫條件下穩(wěn)定保存長達(dá)96 h，使得樣本的長途運輸成為可能。

2 細(xì)胞的檢出率的研究

就目前而言，對于腫瘤細(xì)胞計數(shù)，不存在具有一個公認(rèn)并且經(jīng)過驗證的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，所以在大范圍細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，本研究對CellSearch系統(tǒng)用線性回歸法對細(xì)胞的檢出率進行估計。

在實驗之初，考慮到每個數(shù)據(jù)點需要一個受試者7.5 mL全血，且分析數(shù)據(jù)需要花費數(shù)小時，這限定了現(xiàn)有設(shè)備每天可分析的數(shù)據(jù)點的數(shù)目，同時也限制了從健康受試者采集的血液樣本的數(shù)量。

精準(zhǔn)地測量檢出率較為復(fù)雜，大部分細(xì)胞計數(shù)方法的有效檢出率底限約為1×104個細(xì)胞/mL。而CellSearch系統(tǒng)采用的技術(shù)可應(yīng)用在細(xì)胞濃度很低時，這個濃度遠(yuǎn)低于血球儀計和全自動血液檢驗設(shè)備的極限值。1 000個細(xì)胞/7.5 mL樣本，即相當(dāng)于約133個細(xì)胞/ mL，這個水平比具有代表性的血球儀計的極限要低兩個數(shù)量級。對于系統(tǒng)靈敏度范圍的下限，4個腫瘤細(xì)胞/ 7.5 mL全血，即僅0.53個細(xì)胞/mL。沒有任何一種已知方法，能可靠地精準(zhǔn)到這個水平。同時區(qū)別腫瘤細(xì)胞與血液中其他有形成分也存在問題。細(xì)胞計數(shù)可在濃縮的細(xì)胞原料上進行，然后再對細(xì)胞原料進行稀釋，但是細(xì)胞計數(shù)法的誤差需乘以一個很大的稀釋因子，導(dǎo)致預(yù)期細(xì)胞計數(shù)產(chǎn)生很大、不可接受的不精確度。和CellSearch系統(tǒng)公司討論研究后開發(fā)出一種流式細(xì)胞儀細(xì)胞計數(shù)方法，這種方法能夠在比血液檢驗儀器所需濃度低的條件下對細(xì)胞進行計數(shù)，并且能夠區(qū)分腫瘤細(xì)胞和血液中其他有形成分。

簡而言之，采用流式細(xì)胞法測定加標(biāo)細(xì)胞計數(shù)，測定全血樣本標(biāo)記原材料中腫瘤細(xì)胞即SKBr-3細(xì)胞的濃度。流式細(xì)胞儀絕對計數(shù)熒光粒子購自Bechman-Coulter公司。共用3個試管，每個試管均置入200 μL的ImmunipermTM、10 μL的抗角蛋白藻紅蛋白和100 μL待測細(xì)胞懸浮液。然后將這些試管培養(yǎng)15 min，提高細(xì)胞的通透性和細(xì)胞角蛋白染色。另取2個試管接收500 μL的Autoprep系統(tǒng)緩沖液。然后將5個試管均放入購自Bechman-Coulter公司的20 μL熒光粒子(約26 000個)。把5個試管做渦旋式混合，在購自Becton-Dickinson公司的FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀上運行放置緩沖液的2個試管。直到試管中100%的樣本被操作完成。測定出所增加的熒光粒子實際的總數(shù)目。接著對3個試管進行操作，當(dāng)收集到了13 000個熒光珠時，即試管約50%的樣本被運行時，數(shù)據(jù)停止采集。然后根據(jù)已計數(shù)的熒光粒子的數(shù)目與熒光粒子總數(shù)目計算出兩者之間的比值，從而計算出已運行的試樣的體積。因此，如果待測細(xì)胞懸液在CellSearch系統(tǒng)中測出的細(xì)胞計數(shù)為200，那200則為待測細(xì)胞懸液所有獲得細(xì)胞計數(shù)，乘上已計數(shù)的熒光粒子的數(shù)目與熒光粒子總數(shù)目，計算出兩者之間的比值。最后就得到了待測細(xì)胞懸液所有獲得細(xì)胞個數(shù)。

3 線性度檢測方法的研究

采集5個受試者血液保存在Cellsave的儲存管中，然后每個儲存管分別重新配置成6個試管，每個試管裝有7.5 mL受試者血液。在第一個試管中放入固定SKBr-3細(xì)胞懸液90 μL(約含有1.45×104個細(xì)胞/mL)，第一個試管作為最高細(xì)胞濃度，約為1 300個SKBr-3細(xì)胞加入到血樣。然后將第二個90 μL細(xì)胞懸液與PBS緩沖液以1:3稀釋，以此類推，制成在PBS緩沖液中的4個稀釋度，PBS緩沖液中含有5%的BSA牛血清白蛋白。把各個梯度的細(xì)胞懸液加到各自相應(yīng)的血樣試管中。最后一個試管不添加細(xì)胞懸液。即每個受試者的6個試管中，分別含有1300、325、81、20、5和0個SKBr-3細(xì)胞。所有的30個試管全部分別混合，在室溫下靜置過夜，在處理前不再進行混合。然后把所有的試管都放置在同一臺Autoprep系統(tǒng)上運行。并在同一臺Analyzer系統(tǒng)處理。

表1中列出了在寬廣范圍內(nèi)的細(xì)胞濃度的實測細(xì)胞計數(shù)和預(yù)期腫瘤細(xì)胞計數(shù)的對比。在這個實驗中在最高腫瘤細(xì)胞濃度中的5個結(jié)果中，平均檢出率為93%。分析后細(xì)胞損失可能為：1）通過Autoprep系統(tǒng)制備回收7.5 mL血樣中的腫瘤細(xì)胞的回收率僅為93%；2）通過CellSearch 系統(tǒng)檢測到僅存在93%的腫瘤細(xì)胞；3）上述兩種均有。

表1 實測與預(yù)期腫瘤細(xì)胞數(shù)目Tab.1 The observed and expected number of tumor cells

表2 檢測偏差Tab.2 Detection deviation

表1和表2列舉了用CellSearch 系統(tǒng)測出的全血中腫瘤細(xì)胞數(shù)目與加入樣本中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目是基本一致的。在實驗中每個濃度的相對精度在93%到140%范圍間。從數(shù)據(jù)上看，低細(xì)胞濃度范圍使用該比較方法是不精準(zhǔn)的，在最低細(xì)胞濃度范圍中，偏差2個細(xì)胞的相對偏差近乎一半。綜合考慮，所有數(shù)據(jù)用最小二乘擬合方式線性回歸見圖1。

圖1 預(yù)期細(xì)胞數(shù)目—實測細(xì)胞計數(shù)線性回歸分析Fig.1 The expected number of measured cell - cell count linear regression analysis

圖1 直觀地列出了實測腫瘤細(xì)胞計數(shù)和預(yù)期腫瘤細(xì)胞計數(shù)對比?；貧w曲線的斜率為0.932。R2大于0.95說明X軸選擇的數(shù)據(jù)范圍是足夠的。曲線中斜率0.932說明約93%腫瘤細(xì)胞放進樣本中。R2等于0.999說明實測腫瘤細(xì)胞數(shù)目與加入樣本中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目是線性一致的?；貧w數(shù)據(jù)表明截距為3.867。95%的置信度區(qū)間為[-2.31, 10.04]，且過零。因此在統(tǒng)計上無異于零。

如圖1，本實驗中CellSearch 系統(tǒng)可以精確地測出加入了SKBr-3腫瘤細(xì)胞的全血樣本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目且能測出最大的腫瘤細(xì)胞達(dá)1 238個。結(jié)果表明CellSearch 系統(tǒng)所檢測出的數(shù)據(jù)是線性的，與臨床相關(guān)腫瘤細(xì)胞數(shù)目是線性一致的，所用計數(shù)方法是合理的。

由于圖1中的斜率是0.932而不是1，在前面已經(jīng)分析過0.93%的原因。為了排除掉檢出率這個變量的因素，采用稀釋系列中最高細(xì)胞數(shù)目來設(shè)置系列中后續(xù)稀釋度的預(yù)期細(xì)胞數(shù)目，即我們認(rèn)為最高細(xì)胞數(shù)目的測量是100%準(zhǔn)確的。這樣將回收率與最高腫瘤細(xì)胞濃度樣本的檢出率分開來考慮，后續(xù)試管的預(yù)期值為最高試管的實測值除以稀釋因子。分析得知斜率必須為1，截距在統(tǒng)計上等于0，更高的R2，以表示93%的回收率是采樣不能捕獲7%的細(xì)胞，而不是系統(tǒng)未檢出這7%的細(xì)胞。于是CellSearch 系統(tǒng)的檢測是線性的，檢出率在受試腫瘤細(xì)胞范圍內(nèi)是一致的，表3和圖2顯示了這一分析結(jié)果。

表3 連續(xù)稀釋的實測與預(yù)期腫瘤細(xì)胞數(shù)目Tab.3 The observed and expected number of tumor cells continuously diluted

圖2 預(yù)期細(xì)胞數(shù)目—實測細(xì)胞計數(shù)線性回歸分析Fig.2 The expected number of measured cell-cell count linear regression analysis

表3中的實測值與表1所列的值相同，然而，預(yù)期值發(fā)生變化。因為預(yù)期值是通過最高濃度樣本的實測值連續(xù)除以稀釋因子得到的，是按比例稀釋的理想狀態(tài)。另外，對于圖2中的線性回歸中，對于每個受試者的最高腫瘤細(xì)胞數(shù)目的預(yù)期值和實測值都被除外，因為已經(jīng)假設(shè)為相等的，計算出預(yù)期值，與實測值相比較，僅是用于人工的改善分析。

圖2顯示了CellSearch 系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞連續(xù)稀釋度的響應(yīng)。對實測腫瘤細(xì)胞數(shù)與預(yù)期腫瘤細(xì)胞數(shù)進行回歸分析，生成的斜率1.007，截距3.028，R2等于0.990，R等于0.995。因此，一旦樣本的回收率被計算出，在很大的腫瘤細(xì)胞試樣范圍內(nèi)，該比例都不會變化。在該研究中，在4～255個細(xì)胞范圍內(nèi)，斜率為0.994，截距為5.712，R2等于0.991。圖1和圖2的數(shù)據(jù)證實，CellSearch系統(tǒng)在受試腫瘤細(xì)胞范圍內(nèi)是線性的（0～1 238個細(xì)胞）。回歸數(shù)據(jù)分析表明，截距3.028，95%的置信區(qū)間為[-3.3, 9.22]，這個區(qū)間與零重疊，因此在統(tǒng)計上無異于零。

CellSearch 系統(tǒng)在廣泛的臨床相關(guān)范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞檢出率是基本一致的，線性的。檢出率可能因受試者不同而不同；然而，斜率0.932或1.007表明，對于一個受試者，檢出率是不應(yīng)受試細(xì)胞變化而變化的，因此，當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)目變化時，CellSearch系統(tǒng)的響應(yīng)是1:1的。R2等于0.999和0.990證實，CellSearch系統(tǒng)響應(yīng)的線性度符合預(yù)定用途，且兩種檢驗方法都是可取的。

4 結(jié)論

通過對CellSearch 系統(tǒng)采用流式細(xì)胞法計數(shù)從而解決對低濃度條件下血液檢測儀器無法進行計數(shù)的問題，檢驗出最終結(jié)果CellSearch 系統(tǒng)的檢出率達(dá)到93%。其中7%的細(xì)胞損失可能是Autoprep系統(tǒng)在采樣回收中的損失，或是Analyzer系統(tǒng)的檢測性能的限制。為了排除這93%的回收率是否由Autoprep系統(tǒng)或是Analyzer系統(tǒng)造成的而采取了連續(xù)稀釋法進行分析，最終得到斜率為1.007，R2等于0.990。也就是說當(dāng)預(yù)期細(xì)胞數(shù)目增加多少，CellSearch 系統(tǒng)檢測到的細(xì)胞數(shù)目也增加多少，證明了CellSearch 系統(tǒng)的有效性。

通過對CellSearch 系統(tǒng)對細(xì)胞檢出率和線性度性能檢測方法的研究，試驗出了一套可行的針對低濃度范圍細(xì)胞檢測儀器的檢驗方法，為上市前類似儀器的線性度檢驗方法總結(jié)出了實際檢驗意義。

[1] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[2] Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells(CTC) detection: clinical impact and future directions[J]. Canc Lett, 2007, 253(2): 180-204.

Study on the Detection Rate of Cell and Linearity Performance Detection Method in the CellSearch System

【 Writers 】CHEN Xinyuan, ZHANG Zhijing
Shanghai Testing & Inspection Institute for Medical Devices, Shanghai, 201318

circulating tumor cells, detection rate of cells, linearity, detection method

R318.6

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.01.017

1671-7104(2016)01-0058-03

2015-02-27

陳信元，E-mail: 18621687007@163.com

【 Abstract 】Research on CellSearch system's detection rate of cells and linearity performance detection method, so as to analyze the accurate and reasonable detection method to meet the CellSearch characteristics of the system.