李 明， 宋婷婷,鄭榮泉,鄭善堅(jiān)*， 胡文芳,駱?biāo)囋?，?yán) 紅

(1.浙江師范大學(xué)生化學(xué)院，浙江金華 321004; 2.浙江省金華市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江金華 321000；3.浙江省紹興市第一中學(xué)，浙江紹興 312000)

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棘胸蛙歪頭病病原分離·鑒定與藥敏試驗(yàn)

李 明1,2， 宋婷婷1,鄭榮泉1,鄭善堅(jiān)1*， 胡文芳1,駱?biāo)囋?，嚴(yán) 紅1

(1.浙江師范大學(xué)生化學(xué)院，浙江金華 321004; 2.浙江省金華市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江金華 321000；3.浙江省紹興市第一中學(xué)，浙江紹興 312000)

摘要[目的]分離并鑒定棘胸蛙歪頭病病原。[方法]從患歪頭病棘胸蛙(Quasipaa spinosa)體內(nèi)分離到致病菌，分別采用4種不同方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA測序等方法進(jìn)行鑒定，并采用抑菌圈研究該菌株對12種抗生素的敏感性。[結(jié)果]除口服方式外，肌肉注射、皮膚損傷浸泡、皮膚不損傷浸泡感染途徑均能使棘胸蛙發(fā)病并導(dǎo)致死亡，且對蛙有較強(qiáng)的致病性。通過生理生化試驗(yàn)和16S rDNA測序等方法鑒定致病菌為腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：該致病菌對萬古霉素、頭孢哌酮、慶大霉素和紅霉素高度敏感，而對吡哌酸、鏈霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素不敏感。[結(jié)論]棘胸蛙歪頭病病原為腦膜炎敗血金黃桿菌。

關(guān)鍵詞棘胸蛙；腦膜炎敗血金黃桿菌；16S rDNA；藥敏試驗(yàn)

Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test of the Pathogen ofQuasipaaspinosa

LI Ming1,2,SONG Ting-ting1,ZHENG Rong-quan1, ZHENG Shan-jian1*et al (1.College of Chemistry and Life Science,Zhejiang Normal University,Jinhua,Zhejiang 321004; 2.Jinhua Fishery Technical Extension Station of Zhejiang Province,Jinhua,Zhejiang 321000)

Abstract [Objective] To isolate and identify the pathogen ofQuasipaaspinosa.[Method] Pathogenic bacteria were isolated fromQ.spinosa.Infection experiment was carried out by four different methods.Pathogenic bacteria were identified by morphologic observation,physiology biochemistry experiment,and 16S rDNA sequence.Sensitivity of strains to 12 antibiotics was researched by inhibition zone.[Result] Except oral administration,intramuscular injection,skin injury soaking,skin soaking without injury could all lead to the death ofQ.spinosa,and had relatively strong pathogenicity to frogs.Identification by biophysical and biochemical tests and 16S rDNA sequence showed that the pathogenic bacterium wasChryseobacteriummeningosepticum.Drug sensitive test showed thatC.meningosepticumwas highly sensitive to vancomycin,cefoperazone,gentamicin and erythromycin,but was not sensitive to pipemidic acid,streptomycin,tetracycline,norfloxacin,penicillin,neomycin,lincomycin and cephalothin.[Conclusion] The pathogenic bacterium ofQ.spinosawasC.meningosepticum.

Key wordsQuasipaaspinosa;Chryseobacteriummeningosepticum; 16S rDNA; Drug sensitivity test

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)主要分布于我國長江以南地區(qū)，是一種兼具食用和藥用價(jià)值的蛙類[1]。但是，由于棘胸蛙養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度提高和種質(zhì)衰退等原因，棘胸蛙疾病種類和病害也相應(yīng)增多，國內(nèi)已報(bào)道了棘胸蛙的紅腿病、爛皮病、黑肝病等10余種疾病，已成為困擾棘胸蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一[2-6]。近年來，在棘胸蛙養(yǎng)殖區(qū)浙江省麗水、杭州等地區(qū)暴發(fā)了一種以歪頭為主要特征的流行病，該病可以在不同階段的棘胸蛙蛙群中流行，主要危害體質(zhì)量100 g以上的大蛙，常發(fā)于變態(tài)以后，蝌蚪期偶見。病蛙皮膚發(fā)黑，在水面出現(xiàn)間歇性旋轉(zhuǎn)，身體失去平衡力，游動(dòng)時(shí)身體打轉(zhuǎn)，腹部朝上，頭部歪斜朝向一邊，厭食懶動(dòng)，應(yīng)激能力差，與葉雪平等[7]報(bào)道的牛蛙腦膜炎(歪脖子病)疾病癥狀相似。該病傳染性強(qiáng)，死亡率高，發(fā)病時(shí)間一般在7~10 月，水溫在20 ℃以上，從發(fā)病到死亡一般為4~7 d。棘胸蛙歪頭病以歪頭為典型癥狀，死亡率高，對棘胸蛙養(yǎng)殖造成較大的危害。筆者從病蛙體內(nèi)分離出致病菌，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA測序確定致病菌為腦膜炎敗血金黃桿菌。腦膜炎敗血金黃桿菌是蛙類的常見致病菌，也稱腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)或腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)，在牛蛙、美國青蛙上造成較大危害[8-11]。但是，腦膜炎敗血金黃桿菌在棘胸蛙上發(fā)現(xiàn)報(bào)道尚屬首次。筆者對浙江省麗水地區(qū)發(fā)生的棘胸蛙歪頭病進(jìn)行病原分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為棘胸蛙歪頭病的診斷及有效防控提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物?；技赝芡犷^病的病蛙材料取自浙江省麗水某棘胸蛙養(yǎng)殖場；試驗(yàn)用健康棘胸蛙購自浙江省金華市婺城區(qū)綠谷清泉養(yǎng)殖合作社，平均體質(zhì)量為(100±15)g/只。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下飼養(yǎng)觀察3 d后，用于試驗(yàn)。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，每天投喂鮮活黃粉蟲1次，吸污換水1次，養(yǎng)殖用水為經(jīng)曝氣2 d的自來水，pH為7.2，水溫(22±1)℃，養(yǎng)殖試驗(yàn)用水族箱為120 cm×60 cm×60 cm，水位5 cm，斜置木板架供棘胸蛙棲息。

1.1.2試劑。16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒，購自TaKaRa公司；細(xì)菌生化鑒定管、細(xì)菌藥敏紙片，均購自杭州天和微生物制劑有限公司；其他試劑為實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2方法

1.2.1致病菌分離。取典型歪頭病瀕死的棘胸蛙，體表用無菌水沖洗、75%乙醇消毒，無菌操作分別取病蛙的肝、腎、腦組織，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，分別從肝、腎、腦平板上挑選優(yōu)勢菌落，純化后暫標(biāo)記為b-1、b-2、b-3。

1.2.2人工感染試驗(yàn)。

1.2.2.1菌液制備。將純培養(yǎng)的3株細(xì)菌b-1、b-2、b-3，分別接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，置于振蕩頻率為200 r/s的搖床中振蕩培養(yǎng)18 h，使用滅菌生理鹽水采用比濁管法稀釋，配制成5×108CFU/mL濃度的菌液。

1.2.2.2人工感染。將3種制備菌液(濃度均為5×108CFU/mL)分別采用口服(試驗(yàn)I組)、肌肉注射(試驗(yàn)Ⅱ組)、皮膚損傷浸泡(試驗(yàn)Ⅲ組)、皮膚不損傷浸泡(試驗(yàn)Ⅳ組)4種方式感染棘胸蛙。具體感染方法如下：①口服，用滅菌長注射器將菌液按0.4 mL/只的劑量從口腔直接灌入食道；②肌肉注射，先對蛙體背部皮膚消毒后，將菌液按0.2 mL/只的劑量對健康蛙做肌注攻毒試驗(yàn)；③皮膚損傷浸泡，對蛙體背部皮膚用乙醇擦拭消毒后，用無菌針頭劃傷背部皮膚，置于5×108CFU/mL菌液中浸泡1 h；④皮膚不損傷浸泡，對蛙體體表用乙醇擦拭消毒后，置于5×108CFU/mL菌液中浸泡1 h。所有試驗(yàn)組人工感染后都轉(zhuǎn)入已消毒的水簇箱中飼養(yǎng)。同時(shí)，設(shè)置2個(gè)對照組(對照組 Ⅰ 和對照組 Ⅱ)：對照組 Ⅰ 注射生理鹽水，注射劑量為0.2 mL/只；對照組 Ⅱ 為未經(jīng)處理的空白對照。每組隨機(jī)取4只健康棘胸蛙，感染試驗(yàn)觀察15 d。

1.2.3生理生化特性的測定 。對分離的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)，生理生化試驗(yàn)按照杭州天和微生物試劑有限公司的生化管說明書進(jìn)行。

1.2.416S rDNA鑒定。使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒提取菌株的DNA，采用擴(kuò)增細(xì)菌的PCR通用引物，正向引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物合成和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。對致病菌使用16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。將細(xì)菌的16S rDNA 基因序列與 GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行 Blast比對。

1.2.5藥物敏感試驗(yàn)。藥物敏感試驗(yàn)采用藥敏紙片法。將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于28 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，用滅菌生理鹽水稀釋為1×106CFU/mL，取200 μL菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，然后用鑷子將藥敏紙片貼在瓊脂平板表面。于28 ℃恒溫培養(yǎng)12~16 h后測量抑菌圈直徑，參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1病蛙癥狀從圖1可以看出，病蛙外表皮膚發(fā)黑，頭部歪斜朝向一邊，厭食懶動(dòng)，應(yīng)激能力差,身體失去平衡力，游動(dòng)時(shí)身體打轉(zhuǎn)，并同時(shí)伴有部分白內(nèi)障、肝壞死等癥狀。

圖1　患病棘胸蛙的外部特征觀察Fig.1　External characteristics of diseased Quasipaa spinosa

2.2病原分離結(jié)果從患歪頭病的棘胸蛙肝、腎、腦組織中均分離到3株病菌b-1、b-2、b-3。分離的3株細(xì)菌的形態(tài)大小基本一致，革蘭氏染色觀察為陰性短桿菌，在培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，微凸，不透明，微黃色。28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落直徑為2～3 mm。

2.3人工感染試驗(yàn)結(jié)果由表1可知，除口服方式外，其他感染途徑均能使棘胸蛙發(fā)病并導(dǎo)致死亡，且對蛙有較強(qiáng)的致病性。將b-1、b-2、b-3這3個(gè)菌株對健康蛙做肌注攻毒試驗(yàn)中，試驗(yàn)組蛙在4 d內(nèi)100%發(fā)病死亡，其癥狀表現(xiàn)與自然發(fā)病基本相同，對照組全部存活，表明這3個(gè)菌株均為致病菌。

表1　分離菌對棘胸蛙的人工感染結(jié)果

2.4菌株鑒定結(jié)果

2.4.1生理生化鑒定。由表2可知，3個(gè)菌株的生化鑒定結(jié)果完全相同，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《一、二、三類水生動(dòng)物疫病病種名錄釋義》[13]鑒定分離的病原菌株為腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum)。

2.4.216S rDNA測序與鑒定結(jié)果。通過1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得約1 400 bp的條帶。經(jīng)測序，得到長度為1 381 bp 的DNA序列(圖2)。

表2　3株分離菌的生理生化鑒定結(jié)果

注：-表示陰性；+表示陽性。

Note：- and + indicated negative and positive,respectively.

圖2　致病菌16S rDNA的測序結(jié)果Fig.2　Sequencing results of pathogenic bacteris 16S rDNA

將該序列提交GenBank進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)其與腦膜炎敗血金黃桿菌的16S rDNA序列的同源性達(dá)到96%以上，因此鑒定該病原菌為腦膜炎敗血金黃桿菌。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，該致病菌對萬古霉素、頭孢哌酮、慶大霉素、紅霉素高度敏感，而對吡哌酸、鏈霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素不敏感。

3討論與結(jié)論

張奇亞等[10]對腦膜炎敗血金黃桿菌引起的美國青蛙旋游癥進(jìn)行病理組織切片觀察，認(rèn)為腦膜炎敗血金黃桿菌可引起腦組織損傷和腦功能障礙，是導(dǎo)致打轉(zhuǎn)旋游和頭部歪斜的

表3　分離菌對12種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R表示耐藥；S表示敏感。

Note:R was rug resistance;S was wensittivity.

主要原因。但是，引起蛙類歪頭病的病原也不僅僅是腦膜炎敗血金黃桿菌。楊春浩等[11]將美國青蛙的歪頭病的病原鑒定為嗜水氣單胞菌。在棘胸蛙中是否存在其他病原感染引起的歪頭病癥狀，仍有待于進(jìn)一步研究。

腦膜炎敗血金黃桿菌有較強(qiáng)的耐藥性。該試驗(yàn)中致病菌對12種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，僅萬古霉素、紅霉素、頭孢哌酮、慶大霉素4種抗菌藥物對該菌有較好的抗菌作用。陳會(huì)波等[14]采用K-B紙片擴(kuò)散法對牛蛙腦膜炎黃桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明病原對40種試驗(yàn)藥物耐藥，而敏感藥物僅5種。在此次試驗(yàn)的敏感藥物中萬古霉素、紅霉素、頭孢哌酮屬于禁用藥，不能用于棘胸蛙歪頭病的治療，只能選擇慶大霉素作為治療的藥物。因此，在該病的防治上，應(yīng)堅(jiān)持防重于治，并積極探索生態(tài)預(yù)防和免疫預(yù)防的方法。

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收稿日期2015-12-30

作者簡介李明(1974- )，男，浙江金華人，高級工程師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣研究。*通訊作者，副教授，碩士，從事水產(chǎn)病害學(xué)研究。

基金項(xiàng)目浙江省重大科技專項(xiàng)(2010C12008)；浙江省水產(chǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2012R10026-07)。

中圖分類號(hào)S 947.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-064-03