高 漓，譚 寧，張?zhí)煊恚涡↓?，郭維杰，張振鋒，查若朋

酸性微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3遷移并活化Rac1蛋白

高 漓1，譚 寧2，張?zhí)煊?，何小龍1，郭維杰3，張振鋒3，查若朋3

目的探討腫瘤外周酸性微環(huán)境對PC-3前列腺癌細(xì)胞遷移的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法將PC-3前列腺癌細(xì)胞分別培養(yǎng)在不同pH（7.4、7.0、6.6）的細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過體外實驗，分析PC-3細(xì)胞在侵襲、遷移等轉(zhuǎn)移能力上的改變；對細(xì)胞骨架肌動蛋白Actin進(jìn)行染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀測腫瘤外周酸性微環(huán)境對細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合的影響；通過Western blot實驗，檢測腫瘤外周酸性微環(huán)境對PC-3前列腺癌細(xì)胞Rac1蛋白活化的影響。結(jié)果當(dāng)腫瘤外周微環(huán)境向酸性變化時，PC-3細(xì)胞的侵襲及遷移能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；激光共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果提示，腫瘤外周酸性微環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞骨架肌動蛋白的聚合；Western blot檢測結(jié)果顯示，腫瘤外周酸性微環(huán)境促進(jìn)PC-3細(xì)胞Rac1蛋白的活化。結(jié)論腫瘤外周酸性微環(huán)境對PC-3細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用與Rac1蛋白活化密切相關(guān)。

酸性微環(huán)境；前列腺癌；遷移；肌動蛋白；Rac1

前列腺癌是威脅男性健康的常見腫瘤之一，2008年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率和死亡率分別位居全球男性全部惡性腫瘤的第2位（14%）和第6位（6%）［1］。雖然與發(fā)達(dá)國家相比，中國仍是前列腺癌的低發(fā)國家，但近年來隨著中國人口老齡化步伐的加快、前列腺癌診療水平的提高和生活方式的轉(zhuǎn)變等多種原因，中國前列腺癌發(fā)病和死亡均呈明顯上升態(tài)勢［2］。前列腺癌轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者死亡的主要原因，對于已經(jīng)轉(zhuǎn)移的前列腺癌，往往難以通過手術(shù)及放療等治療來獲得理想的治療效果。前列腺癌的轉(zhuǎn)移與否，對前列腺癌治療效果及預(yù)后有決定性的影響。研究［3］顯示，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個相互關(guān)聯(lián)的多步驟的過程，包括原發(fā)癌的擴(kuò)展、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞脫落并在黏附基質(zhì)后侵襲、腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)遷移、轉(zhuǎn)移癌栓的形成、在繼發(fā)組織器官定位生長、以及轉(zhuǎn)移癌繼續(xù)擴(kuò)散等。腫瘤的轉(zhuǎn)移不僅取決于腫瘤細(xì)胞自身的特性，如腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的活化及失活；還涉及到腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用，如腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞［3］，腫瘤細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞［4］，腫瘤細(xì)胞與腫瘤酸性微環(huán)境等［5］。該研究通過將前列腺癌細(xì)胞PC-3培養(yǎng)于不同pH（7.4、7.0、6.6）的細(xì)胞培養(yǎng)基中，以觀察細(xì)胞外周酸性微環(huán)境對PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清購自美國Gemini公司（Cat No.900-208）；DMEM購自美國Gibco公司（Cat No.12430-047）；Alexa FluorR 594 phalloidin購自美國lifetechnologies公司（Cat No.A12381）；Rac1活性檢測試劑盒（Cat No.17-441）購自美國Millipore公司；β-actin（Cat No.sc-47778）購自美國Santa Cruz公司；ECL發(fā)光底物試劑盒購自美國Pierce公司；Transwell小室（內(nèi)徑為6.5mm，孔徑為8.0μm）及MatrigelTM均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)基配制 使用HCl或NaOH將DMEM（Cat No.12430-047）調(diào)至pH 7.4、7.0及6.6，過濾后加入胎牛血清（10%）備用。

1.2.2細(xì)胞體外侵襲實驗 將Transwell小室放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每個上室的聚碳酸酯膜上涂以50μg Matrigel膠（用無血清DMEM稀釋）；下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基800μl。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化，離心（1 000 r/m，5 min）后重懸于無血清DMEM培養(yǎng)液，上室內(nèi)加入2×105個細(xì)胞/室，繼續(xù)使用pH 7.4、7.0及6.6培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基，取出小室。用棉簽拭去膜基質(zhì)和上室內(nèi)表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下拍照并計數(shù)［6］。每組設(shè)3個平行樣本，每個樣本觀測5個視野（10×）并進(jìn)行全孔計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞體外遷移實驗 細(xì)胞體外遷移實驗與侵襲實驗方法相同，但Transwell小室底部膜的內(nèi)表面上未鋪Matrigel。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化，離心（1 000 r/m，5 min）后重懸于無血清DMEM培養(yǎng)液，上室內(nèi)加入2×105個細(xì)胞/室，使用pH 7.4、7.0及6.6培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基，取出小室。用棉簽拭去膜基質(zhì)和上室內(nèi)表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，洗去染色液，空氣干燥，在光學(xué)顯微鏡下拍照。然后加入10%的冰醋酸，靜置30 min，待結(jié)晶紫溶解后，各實驗組分別取100μl于96孔板中，使用光柵型連續(xù)波長酶標(biāo)儀（infinite M200 PRO儀器），讀取各孔在560 nm波長處吸光值并記錄。每組設(shè)3個平行樣本，實驗重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞骨架肌動蛋白Actin染色 PC-3細(xì)胞分別使用pH7.4及pH6.6培養(yǎng)48 h后，用PBS液漂洗蓋片培養(yǎng)的細(xì)胞3次，之后用4%的甲醛/PBS液固定細(xì)胞10 min，PBS漂洗3次；用Alexa FluorR 594 phalloidin在（1∶10）室溫中反應(yīng)15 min后，PBS漂洗3次，使用60%甘油+熒光防淬劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，激發(fā)波長581 nm，發(fā)射波長609 nm。

1.2.5Rac1活化蛋白檢測 PC-3細(xì)胞分別使用pH7.4及pH6.6培養(yǎng)48、72 h后，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot實驗。將提取的蛋白，經(jīng)丙烯酰胺凝膠（12%分離膠+6%濃縮膠）電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，Rac1一抗（1∶500稀釋，鼠源性）、β-actin一抗（1∶500稀釋，鼠源性）4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000稀釋）孵育2 h，TBST洗滌，與免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）反應(yīng)，X線片曝光，顯影，定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，取95%可信區(qū)間，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酸性微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的侵襲

在侵襲實驗中，pH 7.4、7.0及6.6組均設(shè)3個平行樣本，實驗重復(fù)3次，在不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后終止實驗。結(jié)果統(tǒng)計顯示，pH 7.4、7.0及6.6組發(fā)生侵襲的細(xì)胞個數(shù)分別為（134.3±17.55）、（273.7±14.61）、（418.67±14.43），pH6.6組發(fā)生侵襲的細(xì)胞個數(shù)明顯高于pH7.4組及pH7.0組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=124.79，P＜0.01）。見圖1。

2.2 酸性微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的遷移

在遷移實驗中，pH 7.4、7.0及6.6組均設(shè)3個平行樣本，實驗重復(fù)3次。在不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后終止實驗并進(jìn)行結(jié)晶紫染色，然后加入10%的冰醋酸2 ml；待結(jié)晶紫溶解后，取100μl于96孔板中，使用酶標(biāo)儀（infinite M200 PRO儀器）記錄各孔在560 nm波長處吸光值。pH 7.4、7.0及6.6組所測OD值分別為（0.045 1±0.005 8）、（0.066 1± 0.007 9）、（0.136 0±0.008 9），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.501，P＜0.01）。見圖2。

2.3 酸性微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞骨架肌動蛋白的聚合將前列腺癌細(xì)胞PC-3進(jìn)行細(xì)胞爬片，在不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后終止實驗，4%多聚甲醛（D-PBS溶液配制）固定細(xì)胞15 min，使用Alexa FluorR 594 phalloidin對細(xì)胞骨架肌動蛋白進(jìn)行染色，通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀測。觀測結(jié)果顯示，與pH7.4組細(xì)胞相比，pH6.6組的PC-3細(xì)胞內(nèi)的F-actin呈現(xiàn)明亮的紅色，呈細(xì)束狀竹排樣結(jié)構(gòu)，沿細(xì)胞極性平行排列。與pH7.4組細(xì)胞相比，pH6.6組PC-3細(xì)胞內(nèi)的F-actin聚合更明顯。見圖3。

2.4 酸性微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3Rac1蛋白的活化在不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞，于48 h后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Rac1活化蛋白及Rac1 Western blot檢測。實驗結(jié)果顯示，pH6.6組細(xì)胞Rac1活化形式GTP-Rac1明顯高于pH7.4組細(xì)胞（圖4A）。Rac1活化形式GTP-Rac1光密度值與Rac1光密度值比值為：pH7.4組：0.134 3± 0.008 7（經(jīng)GAPDH校正）（n=3），pH7.0組：0.777 7±0.040 4（經(jīng)GAPDH校正）（n=3），pH6.6組：1.173 3±0.028 5（經(jīng)GAPDH校正）（n=3）（F= 506.60，P＜0.01）（圖4B）。

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移分多個步驟進(jìn)行，包括腫瘤細(xì)胞在原位癌的脫離與遷移、侵襲并降解細(xì)胞外基質(zhì)、侵入血液血管和循環(huán)系統(tǒng)、在一個遙遠(yuǎn)的部位再生長等諸多步驟。這一過程不僅與腫瘤的遺傳背景密切相關(guān)，更受到腫瘤所在微環(huán)境的強(qiáng)烈影響。腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的改變是腫瘤微環(huán)境的生成關(guān)鍵因素，腫瘤血管結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)功能的畸變導(dǎo)致腫瘤局部氧氣和營養(yǎng)的供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致腫瘤代謝的變化，腫瘤細(xì)胞代謝重組，其能量代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變［7］。腫瘤細(xì)胞糖酵解的發(fā)生，以及腫瘤血管結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)功能畸變所導(dǎo)致的低灌注，使腫瘤細(xì)胞外周乳酸升高，從而使腫瘤外周呈明顯的酸化［8］。酸性腫瘤微環(huán)境不僅促進(jìn)血管生成［9］，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)［10］，更影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。本研究的侵襲及遷移實驗中，使用不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC-3，發(fā)現(xiàn)酸性微環(huán)境可以明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的侵襲與遷移。

研究［12］表明，pH值可以刺激細(xì)胞的運(yùn)動遷移，并導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組。本研究使用不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC-3，采用Alexa FluorR 594 phalloidin對細(xì)胞骨架肌動蛋白（Actin）進(jìn)行染色，通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀測。觀測結(jié)果顯示，與pH7.4組細(xì)胞相比，pH6.6組的PC-3細(xì)胞內(nèi)的F-actin呈現(xiàn)明亮的紅色，呈細(xì)束狀竹排樣結(jié)構(gòu)，沿細(xì)胞極性平行排列。證實酸性微環(huán)境可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞骨架肌動蛋白（Actin）的聚合。

細(xì)胞運(yùn)動過程不但涉及細(xì)胞不同部位的肌動蛋白骨架的連續(xù)重構(gòu)，還包括遷移細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附和解黏附過程，該過程包括如下幾個步驟：細(xì)胞在運(yùn)動方向上形成片狀偽足及絲狀偽足、在偽足面上細(xì)胞表面蛋白酶（例如基質(zhì)金屬蛋白酶）選擇性降解細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞遷移前緣與細(xì)胞外基質(zhì)形成新的黏附點而后緣的黏附結(jié)構(gòu)解離［13］，細(xì)胞運(yùn)動過程主要由Rho蛋白家族的一組Ras相關(guān)蛋白進(jìn)行調(diào)控［14］。

目前為止，在人類細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多個Rho蛋白家族成員，分為3個亞家族—Rho蛋白、Rac蛋白和Cdc42蛋白。該蛋白家族成員結(jié)合GTP時處于活化狀態(tài)，當(dāng)GTP水解成GDP時處于失活狀態(tài)［15］。Rho蛋白家族在調(diào)節(jié)肌動蛋白（細(xì)胞骨架）的活動、細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞變形中起關(guān)鍵作用，從而調(diào)控細(xì)胞遷移、參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。其中亞家族Rac1全稱為Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1，有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，片狀偽足形成，細(xì)胞形體極化，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動與遷移，促進(jìn)血管生成的作用。Rac1對細(xì)胞侵襲和遷移的可能機(jī)制為：①促進(jìn)整合素家族蛋白在細(xì)胞頭部募集，并將細(xì)胞級聯(lián)信號傳遞到細(xì)胞肌動蛋白骨架，誘導(dǎo)肌動蛋白微絲聚集，產(chǎn)生片狀偽足；②活化下游重要調(diào)節(jié)因子凝溶膠蛋白，改變肌動蛋白細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞的運(yùn)動及侵襲力；③通過與下游的血小板源性生長因子的信號途徑、百日咳毒素敏感性G蛋白及cAMP依賴性途徑相互作用影響細(xì)胞的運(yùn)動［16］。本研究使用不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC-3，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)酸性微環(huán)境明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3 Rac1蛋白的活化。

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Acidic extracellular m icroenvironment promotes PC-3 cell m igration and enhances the activity of Rac1

Gao Li1，Tan Ning2，Zhang Tianyu1，et al
（1Dept of Urology，The Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guilin 541004；2The Center of Science Research，Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo investigate whether tumor acidic-microenvironment can promote the migration of human prostatic carcinoma cell PC-3.MethodsPC-3 cellswere cultured inmediawith different pH values（pH 7.4，pH 7.0，pH 6.6）.Invasion and migration assay were utilized to analyze themetastasis of PC-3 cells in vitro.F-actin fluorescence staining was performed and observed by 1aser confocal scanning microscope.The activation of Rac1 was examined by western blot.ResultsAcidic microenvironment could enhance the capacity of PC-3 cellmigration and invasion remarkably（P＜0.01）.Meantime，the intensity of F-actin significantly was increased and the activity of Rac1was up-regulated.ConclusionThe results suggest that acidic microenvironmentmay be involved in cancermetastasis and play an important role in promotion of cancermetastasis.

acidic extracellularmicroenvironment；human prostatic cancer；migration；actin；Rac1

R 737.25

A

1000-1492（2016）03-0333-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.010.html

2015-12-08接收

廣西自然科學(xué)基金項目（編號：2010GXNSFA183013）；桂林市科學(xué)研究與術(shù)開發(fā)計劃項目（編號：20130120-15）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科、2桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，桂林 541004

3上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點實驗室，上海 200032

高 漓，男，副主任醫(yī)師；

譚 寧，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wind146wind@aliyun.com