廖貴益，鐘金彪，趙 飛，朱道方

◇技術(shù)與方法◇

HLA-G慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒顆粒的包裝

廖貴益，鐘金彪，趙 飛，朱道方

設(shè)計(jì)合成全長(zhǎng)人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）基因系列，在克隆質(zhì)粒pLV-EF1a-EGFP-N的基礎(chǔ)上構(gòu)建HLA-G基因慢病毒表達(dá)載體，測(cè)序鑒定pLV-EF1a-EGFP-N-HLA-G構(gòu)建成功。與包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，包裝出高效感染率的慢病毒顆粒，測(cè)定病毒滴度為1×109TU/ml。HLA-G慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒顆粒的包裝為轉(zhuǎn)染HLA-G誘導(dǎo)移植腎免疫耐受的研究奠定了基礎(chǔ)。

HLA-G；慢病毒；基因工程；免疫耐受

人類白細(xì)胞抗原G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）是一種非經(jīng)典的HLA-I類分子，其編碼基因與分子結(jié)構(gòu)與經(jīng)典HLA-I類分子相似。HLA-G的特點(diǎn)是分子胞內(nèi)段僅6個(gè)氨基酸殘基且缺乏經(jīng)典HLA-I類分子保守的絲氨酸殘基，是其高效穩(wěn)定表達(dá)在細(xì)胞膜表面的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。1987年Geraghty首次克隆HLA-G基因，其位于6號(hào)染色體短臂，編碼4種膜結(jié)合型HLA-G和2種可溶性HLA-G。各型HLA-G通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生全面持久的抑制作用，在胎兒、眼球等免疫赦免區(qū)的免疫耐受及腫瘤的免疫逃逸中起著重要作用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使移植腎表達(dá)HLA-G可望建立移植腎的免疫耐受。該實(shí)驗(yàn)即構(gòu)建攜帶HLAG基因的慢病毒載體，包裝慢病毒顆粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染HLA-G基因誘導(dǎo)移植腎免疫耐受的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、細(xì)菌和細(xì)胞 攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒表達(dá)載體pLV-EF1a-EGFP-N及包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；DH5a感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)自上海TIANGEN公司；293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.1.2主要試劑 EcoR I、BamH I、T4連接酶和DNA marker購(gòu)自加拿大MBI Fermentas公司；PCR引物由生工生物工程（上海）公司合成；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海QIAGEN公司；PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司；RNAi-Mate購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1HLA-G基因的合成 參照GenBank，提交北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成全長(zhǎng)HLAG基因片段，上游引入EcoR I切點(diǎn)和增強(qiáng)基因表達(dá)的Kozak序列（GCCACC），下游引入BamH I切點(diǎn)。

1.2.2克隆載體與HLA-G基因片段的雙酶切 用EcoR I、BamH I分別雙酶切攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒表達(dá)載體pLV-EF1a-EGFP-N（圖1）和HLA-G基因片段。HLA-G酶切反應(yīng)體系：HLA-G 20μl、EcoR I 1.5μl、BamH I 3μl、10×buffer 20μl加ddH2O至100μl。pLV-EF1a-EGFP-N酶切反應(yīng)體系：pLV-EF1a-EGFP-N 10μl、EcoR I 1.5μl、BamH I 3μl、10×buffer 20μl加ddH2O至100μl。37℃水浴保溫4～6 h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并凝膠回收目的條帶。

1.2.3HLA-G慢病毒載體構(gòu)建 將酶切好的HLA-G連接到pLV-EF1a-EGFP-N載體上。連接反應(yīng)體系：HLA-G 1.5μl、pLV-EF1a-EGFP-N 1μl、10×T4連接buffer 0.5μl、T4連接酶0.5μl、PEG4000 0.5μl加ddH2O至5μl。將連接反應(yīng)液22℃孵育30 min轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)，涂于帶有Amp抗性的LB培養(yǎng)皿中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選6個(gè)克隆進(jìn)行PCR陽(yáng)性篩選，上游引物EF-F：ATTCTCCTTGGAATTTGCCCT；下游引物pEGFP-N-3′：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。將陽(yáng)性克隆送到擎科新業(yè)公司測(cè)序備用。

1.2.4慢病毒顆粒包裝 293T細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)皿，10%FBSDMEM、37℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。按比例將pLV-EF1a-EGFP-HLA-G和包裝質(zhì)粒（pGag/ Pol、pRev、pVSV-G）加入無(wú)血清DMEM離心管。將300μl RNAi-Mate加入另一無(wú)血清DMEM離心管。室溫放置5 min后兩管混合，混合物室溫再放置20～25 min。除去293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，再加入混合物，混勻，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中溫育4～6 h。吸棄培養(yǎng)液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)皿中上清液吸到離心管中，4℃，4 000 r/min離心4 min。將離心管上清液倒入注射器內(nèi)，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾。濾液在離心機(jī)中超速離心，4℃，20 000 r/min，2 h。將濃縮的病毒液收集分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5慢病毒滴度測(cè)定 293T細(xì)胞培養(yǎng)至90%融合時(shí)，傾去培養(yǎng)液，用3 ml D-Hank液洗滌兩次。加1 ml Trypsin-EDTA液，混勻，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3～5 min。再加入2 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使形成單細(xì)胞懸液。按3×10細(xì)胞/孔的濃度接種96孔板，混勻后于37℃5% CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液10μl，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液十倍稀釋3個(gè)～5個(gè)梯度。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100μl稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，于37℃5%CO2培養(yǎng)24 h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100μl 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液于37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過(guò)FACS計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 HLA-G基因的合成參照GenBank提交的系列，北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司成功合成全長(zhǎng)HLA-G基因片段，并在上游引入EcoR I切點(diǎn)（GAATTC）、增強(qiáng)基因表達(dá)的Kozak序列（GCC ACC），在下游引入BamH I切點(diǎn)（GGATCC）。基因系列如下：GAATTC GCCACC ATGGTGGTCATG GCGCCCCGAACCCTCTTCCTGCTGCTCTCGGGGGCC CTGACCCTGACCGAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCC ATGAGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGC CGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTG GACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCG GCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGT GGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAGA CACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGA ATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAG AGCGAGGCCAGTTCTCACACCCTCCAGTGGATGATT GGCTGCGACCTGGGGTCCGACGGACGCCTCCTCCGC GGGTATGAACAGTATGCCTACGATGGCAAGGATTAC CTCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCA GCGGACACTGCGGCTCAGATCTCCAAGCGCAAGTGT GAGGCGGCCAATGTGGCTGAACAAAGGAGAGCCTA CCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCACAGAT ACCTGGAGAACGGGAAGGAGATGCTGCAGCGCGCG GACCCCCCCAAGACACACGTGACCCACCACCCTGT CTTTGACTATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCT GGGCTTCTACCCTGCGGAGATCATACTGACCTGGCA GCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACGTGGAGC TCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCC AGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGG AGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGC TGCCGGAGCCCCTCATGCTGAGATGGAAGCAGTCTT CCCTGCCCACCATCCCCATCATGGGTATCGTTGCTGG CCTGGTTGTCCTTGCAGCTGTAGTCACTGGAGCTGCG GTCGCTGCTGTGCTGTGGAGAAAGAAGAGCTCAGAT CGGGATCC。

2.2 克隆載體與HLA-G基因片段的雙酶切克隆載體pLV-EF1a-EGFP-N與HLA-G基因片段EcoR I、BamH I雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳可見(jiàn)大的pLVEF1a-EGFP-N片段（9 419 bp）與小的HLA-G基因片段（1 020 bp）。見(jiàn)圖2。

2.3 HLA-G慢病毒載體構(gòu)建酶切好的HLA-G與pLV-EF1a-EGFP-N進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)，涂于帶有Amp抗性的LB培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。PCR篩選挑選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆送雙向測(cè)序，結(jié)果與HLA-G基因序列進(jìn)行比對(duì)，顯示構(gòu)建序列與預(yù)計(jì)堿基序列完全一致并且插入方向正確（圖3），攜HLA-G基因慢病毒表達(dá)載體pLVEF1a-EGFP-N-HLA-G構(gòu)建成功。

2.4 慢病毒顆粒包裝與滴度測(cè)定構(gòu)建的pLVEF1a-EGFP-HLA-G和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，再以DMEM完全培養(yǎng)液十倍稀釋病毒原液4個(gè)梯度分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后通過(guò)FACS計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞（圖4），結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度為1×109TU/ml，侵染時(shí)間均為72 h。

3 討論

HLA-G特異性表達(dá)在妊娠期絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層［1-3］、眼球、胸腺髓質(zhì)間上皮細(xì)胞等免疫赦免區(qū)，也普遍表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中參與腫瘤的免疫逃逸［4-6］，證實(shí)HLA-G是天然存在的、強(qiáng)力的免疫抑制劑。HLA-G能與T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞作用產(chǎn)生強(qiáng)效廣泛的免疫抑制作用，可望成為誘導(dǎo)免疫耐受的有效靶基因。

慢病毒載體來(lái)源于人類免疫缺陷病毒1，目前被普遍用于研究領(lǐng)域，是基因轉(zhuǎn)染相關(guān)研究的有力工具［7］，其能在宿主細(xì)胞內(nèi)以自己的RNA為模板，在自身反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，形成整合前復(fù)合體。然后在病毒整合酶的作用下，整合到宿主細(xì)胞的染色體上，隨宿主細(xì)胞染色體的復(fù)制表達(dá)而復(fù)制表達(dá)。慢病毒載體與脂質(zhì)體等其他基因轉(zhuǎn)染方法相比較有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)［8-9］：安全性高、轉(zhuǎn)染效率高、可轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞；可整合入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)、能攜帶較大且多個(gè)外源基因、感染細(xì)胞后能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因。因此選用慢病毒載體作為HLA-G基因的轉(zhuǎn)染工具，以確保HLA-G基因高效、穩(wěn)定、長(zhǎng)期表達(dá)在目的細(xì)胞或器官中。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建載體攜帶綠色熒光蛋白基因，感染細(xì)胞后可以表達(dá)綠色的熒光，便于在熒光顯微鏡下直接觀察。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建HLA-G基因慢病毒表達(dá)載體，并包裝出具有高效感染率的慢病毒顆粒，為下一步將HLA-G基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Construction of lentiviral vector carrying HLA-G gene and packing of the lentiviruses

Liao Guiyi，Zhong Jinbiao，Zhao Fei，et al
（Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

The human leucocyte antigen-G（HLA-G）gene was synthesized.According to gene sequencing，the lentiviral vector carrying HLA-G was constructed successfully on the basis of cloning plasmid pLV-EF1a-EGFP-N. The constructed lentiviral vectorwas transferred into 293T package cellwith pGag/Pol，pRev and pVSV-G and the lentiviruseswith high infection efficiencywere produced.The virus titerwas1×109TU/ml.Construction of lentiviral vector carrying HLA-G gene and packing of the lentiviruses laid thematerial foundations for the study of HLA-G gene in inducing immune tolerance of transplanted kidney.

HLA-G；lentivirus；gene engineering；immune tolerance

R 392.4

A

1000-1492（2016）03-0457-04

時(shí)間：2016/1/28 14：23：11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.068.html

2015-12-08接收

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2014A123）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，合肥 230022

廖貴益，男，副教授，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：liaoguiyi2@sina.com