朱德全, 栗金柳, 王茗悅, 孟祥晨, 許 龍, 周清波, 王長平, 薛 勇

(1. 佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030)

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環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附能力和黏附相關(guān)蛋白的影響

朱德全1,2, 栗金柳1, 王茗悅1, 孟祥晨2*, 許 龍1, 周清波1, 王長平1, 薛 勇1

(1. 佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030)

雙歧桿菌是天然存在于人和動(dòng)物腸道的微生物，對宿主發(fā)揮生物屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫、抗炎和抗腫瘤等有益作用，所以經(jīng)常以益生菌的形式添加到乳制品和其他食品中。雙歧桿菌的黏附定植是持續(xù)發(fā)揮益生作用的前提基礎(chǔ)。然而，雙歧桿菌在生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、儲藏和消費(fèi)過程中受到許多環(huán)境脅迫因素(如熱、氧、酸、膽鹽和滲透壓等)的影響。這些環(huán)境因素會(huì)影響雙歧桿菌黏附能力和黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)。對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌存活的影響、雙歧桿菌黏附能力的影響因素和環(huán)境脅迫對黏附相關(guān)蛋白的影響等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

雙歧桿菌；黏附；定植；黏附相關(guān)蛋白；環(huán)境脅迫因素

雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道最常見的革蘭氏陽性有益細(xì)菌，約占人體腸道可培養(yǎng)微生物的10%。大量研究表明，雙歧桿菌對宿主具有多種益生功能，可以通過平衡腸道菌群維持機(jī)體的整體健康水平。因此，雙歧桿菌屬的微生物是應(yīng)用較多的益生菌之一，在食品中通常通過添加于乳制品進(jìn)行食用。雙歧桿菌的黏附是發(fā)揮益生功能的前提和先決條件，雙歧桿菌經(jīng)食用后進(jìn)入體內(nèi)，其益生功能的發(fā)揮與在腸道的黏附與定植密切相關(guān)，如黏附能夠縮短痢疾持續(xù)時(shí)間[1]、刺激免疫應(yīng)答[2-3]、競爭排斥病原微生物[4]等。因此，腸道黏附定植能力是篩選益生菌的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[5]。雙歧桿菌在生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、儲藏和消費(fèi)過程中受到許多環(huán)境脅迫因素(如熱、氧、酸、膽鹽和滲透壓等的影響，這些環(huán)境因素會(huì)影響雙歧桿菌多方面的生理特性，如微生物生長及存活、菌體表面特性、黏附能力、黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)等。筆者對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌存活的影響、雙歧桿菌黏附能力的影響因素、環(huán)境脅迫對黏附相關(guān)蛋白的影響等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1　環(huán)境脅迫對雙歧桿菌成活的影響

不同種類的雙歧桿菌菌株對環(huán)境脅迫的耐受能力不同，具有種屬特異性。環(huán)境脅迫條件下雙歧桿菌對的存活率，存活率從高到低依次為動(dòng)物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌等。研究表明，兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌對模擬的胃液環(huán)境表現(xiàn)出非常低的耐受能力，這與Takahashi等[6]的研究結(jié)果一致。Mainville等[7]研究表明動(dòng)物雙歧桿菌的耐酸性顯著高于長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的耐酸性，Matto的研究也同樣證實(shí)了這一結(jié)果。Saarela M等[8]以動(dòng)物雙歧桿菌E2010和長雙歧桿菌E1884為研究對象，分別用pH 3.0和pH 4.0的磷酸鹽溶液對其處理2 h，再用1.4%膽鹽處理3 h，結(jié)果表明長雙歧桿菌E1884經(jīng)過酸處理后存活率顯著下降，經(jīng)過膽鹽處理后，幾乎不生長；進(jìn)一步研究了雙歧桿菌脅迫適應(yīng)和細(xì)菌固有的交叉保護(hù)機(jī)制，長雙歧桿菌E1884和動(dòng)物雙歧桿菌E2010分別經(jīng)過pH 3.5預(yù)處理后其在1.4%膽鹽中的存活率有所提高。Maus J E等[9]將乳雙歧桿菌短時(shí)間暴露在復(fù)合脅迫環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)能提高其耐酸能力。這說明不同雙歧桿菌對脅迫環(huán)境的抵抗能力存在菌株差異，而且在交叉脅迫環(huán)境中，雙歧桿菌的存活率升高還是降低與脅迫因素、各因素處理時(shí)間和菌株種類等都有關(guān)系。目前對雙歧桿菌脅迫環(huán)境的研究主要集中于膽鹽脅迫、酸脅迫、多種消化酶等單一脅迫因素的研究。

2　雙歧桿菌黏附能力的影響因素

研究雙歧桿菌與腸細(xì)胞的黏附通常體外采用細(xì)胞系來進(jìn)行，這主要是由于人體實(shí)驗(yàn)實(shí)施相對困難，而且腸道環(huán)境復(fù)雜。人結(jié)腸癌細(xì)胞系(如Caco-2細(xì)胞株)，由于在體外所表現(xiàn)出的形態(tài)和功能特征能夠模擬成熟腸道上皮細(xì)胞，經(jīng)常作為體外模型用于評價(jià)益生菌的黏附和定植能力。目前，關(guān)于雙歧桿菌的黏附研究較多，而對于經(jīng)歷脅迫后的菌體黏附相對研究較少。

2.1黏附具有種株差異性和宿主差異性不同菌株與腸道上皮細(xì)胞黏附能力各不相同，可能是不同菌株表面也存在著不同的與黏附有關(guān)的物質(zhì)。因此，不同生境雙歧桿菌的黏附能力存在菌株及菌種的差異性。李平蘭等[10]對來自豬和人類糞便中不同種類的乳酸菌在體外與人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞進(jìn)行黏附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有受試菌株中雙歧桿菌的黏附能力最高，而乳桿菌的黏附能力則相對較低；其他菌屬的黏附能力則介于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬之間，充分體現(xiàn)了細(xì)菌對腸道細(xì)胞黏附過程中的菌屬差異性。 Del Re B等[11]對13株長雙歧桿菌的黏附能力進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在明顯的菌株差異。He等[12]研究表明不同的雙歧桿菌菌株對腸黏膜的黏附能力不同，從健康成年人糞便中分離的雙歧桿菌對腸黏膜的黏附能力明顯高于老年人，其中青春型雙歧桿菌表現(xiàn)得尤為明顯。He等[13]研究還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的黏附具有宿主特異性，從人糞便中分離出的雙歧桿菌對腸黏膜的黏附能力強(qiáng)于其對牛腸黏膜的黏附能力。

2.2雙歧桿菌黏附與菌體的“死、活”狀態(tài)有關(guān)一般認(rèn)為，只有活菌才具有黏附能力。Fourniat等[14]研究表明死乳桿菌也具有與活菌相同的黏附能力。倫永志等[15]對雙歧桿菌菌懸液用65 ℃水浴30 min和100 ℃水浴10 min滅活處理后，發(fā)現(xiàn)滅活的雙歧桿菌與活菌均能黏附于腸上皮細(xì)胞周圍，黏附具有顯著的濃度效應(yīng)。Wang L Q等[5]也發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的死活狀態(tài)不是影響?zhàn)じ侥芰Φ囊蛩亍Ｓ捎谒谰旧砭哂袠O高的穩(wěn)定性和安全性，這就為雙歧桿菌的臨床應(yīng)用提供了一條新途徑。但是，目前這一觀點(diǎn)尚未被廣泛接受，用于臨床的微生態(tài)制劑大多為活菌制劑。

2.3環(huán)境因素對雙歧桿菌表面性質(zhì)和黏附能力的影響雙歧桿菌的黏附能力易受環(huán)境中多種因素的影響。研究表明，兩歧雙歧桿菌與Caco-2細(xì)胞和HT-29細(xì)胞黏附的過程中黏附能力很大程度依賴于環(huán)境變化，其中影響較大的包括pH和膽鹽。雙歧桿菌與人腸上皮細(xì)胞的體外黏附受pH等外界環(huán)境的影響。王彥等[16]用低pH的PBS處理兩歧雙歧桿菌，結(jié)果表明不同pH的PBS溶液處理后的兩歧雙歧桿菌的黏附能力均發(fā)生不同程度下降。2001年，Ouwehand等[17]研究發(fā)現(xiàn)BB12與1%和10%的膽鹽共同作用后，黏附能力均顯著低于未處理組。Guglielmetti S等[18]對兩歧雙歧桿菌MMBb75的研究表明雙歧桿菌經(jīng)過濃度為3%牛膽鹽處理后，對Caco-2細(xì)胞的黏附能力極顯著下降，這與Gmez Zavaglia A等[19]的研究結(jié)果一致。Gmez Zavaglia A等[19]分析膽鹽的存在降低了雙歧桿菌表面疏水性同時(shí)使菌體表面電勢升高，致使雙歧桿菌的黏附能力降低。Candela等[20]研究表明膽鹽提高了雙歧桿菌乳亞種BI07對宿主人纖溶酶原系統(tǒng)的相互作用，并推測消化系統(tǒng)中的膽鹽是雙歧桿菌黏附在腸道中的原因。因此，關(guān)于膽鹽對雙歧桿菌粘附影響的研究存在矛盾性。2009年，Guglielmetti等[18]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌與Caco-2和HT-29細(xì)胞的黏附也取決于環(huán)境條件(如糖、膽鹽和pH等)，當(dāng)存在果糖和甘露糖時(shí)MIMBb75與Caco-2的黏附升高；當(dāng)存在牛膽鹽時(shí)，二者之間的黏附下降；此外，pH同樣會(huì)顯著影響細(xì)菌與Caco-2細(xì)胞的黏附以及細(xì)菌的自動(dòng)聚集能力。這些研究表明雙歧桿菌對腸道細(xì)胞的黏附作用是具有鈣依賴性的，但鈣離子濃度過大使得滲透壓增大，反而會(huì)降低雙歧桿菌的黏附能力，無機(jī)鹽離子也會(huì)影響雙歧桿菌的黏附能力。

雙歧桿菌處于脅迫環(huán)境中，細(xì)胞表面物質(zhì)和自動(dòng)聚集能力受環(huán)境脅迫因素的影響，進(jìn)而影響?zhàn)じ侥芰?。王彥等[16]用低pH的PBS處理兩歧雙歧桿菌，結(jié)果表明非致死pH 3.0和pH 3.5處理的雙歧桿菌疏水性顯著提高，自動(dòng)聚集能力顯著降低。1998年，Pérez等[21]用低pH處理和胰蛋白酶雙歧桿菌CIDCA5310和CIDCA5317，測定其表面性質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶使CIDCA5310的自動(dòng)聚集能力喪失，而對沒有聚集能力的CIDCA5317無影響。低pH處理改變了Zeta電勢，對自動(dòng)聚集能力有較大影響。因此，影響自動(dòng)聚集能力的可能是表面的特異性蛋白和菌體表面電荷。Canzi等[22]測定了30株雙歧桿菌的表面物理化學(xué)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B.bifdum和B.adolescentis具有最強(qiáng)的自動(dòng)聚集能力，且受介質(zhì)pH的影響；此外，經(jīng)蛋白酶處理后菌株的自動(dòng)聚集能力有較大變化。因此，自動(dòng)聚集能力與表面的特異性蛋白有關(guān)。Collado等[23]采用BATH測定表面疏水性和聚集能力相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)對碳?xì)浠衔锞哂性礁唣じ侥芰Φ募?xì)菌其自動(dòng)聚集能力也較強(qiáng)，二者具有正相關(guān)性。雙歧桿菌由于不同菌株表面物質(zhì)存在的差異性，黏附素種類的差異性等導(dǎo)致不同雙歧桿菌在相同脅迫處理下表面性質(zhì)的變化也存在較大差異。

3　環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附蛋白的影響

由于菌體細(xì)胞表面蛋白質(zhì)和分泌到細(xì)胞外的蛋白是參與黏附的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，脅迫又會(huì)誘導(dǎo)這些蛋白質(zhì)表達(dá)或編碼這些蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化。Candela等[20]研究表明膽鹽提高了動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BI07與宿主人纖溶酶原系統(tǒng)的相互作用，表明消化道的膽鹽環(huán)境對該菌與宿主相互作用過程具有潛在的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種[20]和長雙歧桿菌[24]長時(shí)間暴露于膽鹽環(huán)境會(huì)導(dǎo)致菌體表面的人纖溶酶原黏附受體——DnaK和烯醇化酶上調(diào)。雖然雙歧桿菌表面的人纖溶晦原受體(DnaK和烯醇化酶)的上調(diào)參與了這一過程，但也不能排除其他機(jī)制的參與。Weiss等[25]對嗜酸乳桿菌NCFM應(yīng)激與黏附相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，該菌在經(jīng)歷體外模擬消化道時(shí)編碼應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)(GroEI、DnaK、ClpP)的基因在胃液環(huán)境中顯著上調(diào)，在十二指腸液環(huán)境中顯著下調(diào)；編碼黏附相關(guān)蛋白質(zhì)(黏蛋白結(jié)合蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、S-層蛋白)的基因在唾液和胃液環(huán)境中不受影響，而其在十二指腸液和膽鹽環(huán)境中顯著上調(diào)。Jin等[26]分析了長雙歧桿菌BBMN68在酸適應(yīng)和生長的不同階段ffh、uvrA、groES和dnaK基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)這些基因在生長的穩(wěn)定期被顯著誘導(dǎo)，但并不被酸脅迫誘導(dǎo)；酸適應(yīng)120 min后，ffh和uvrA基因的下調(diào)表明長雙歧桿菌的酸適應(yīng)在基因表達(dá)水平上不同于其他細(xì)菌。目前，針對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附蛋白的研究不是很多，大多數(shù)都是研究正常細(xì)菌對細(xì)胞的黏附。

4　小結(jié)

由于益生菌定植于人體腸道發(fā)揮益生作用前，會(huì)受到胃液的酸性環(huán)境和小腸膽鹽、消化酶、滲透壓等多重環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素一方面對益生菌的存活造成一定的影響，另一方面通過影響菌體表面的疏水性、物理性質(zhì)和自動(dòng)聚集能力以及菌體表面蛋白的表達(dá)，從而改變菌體在腸道的黏附定植能力，可能會(huì)進(jìn)一步影響益生菌在人體內(nèi)益生作用的發(fā)揮。

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Effects of Environmental Stress on Adhesion Ability and Proteins Related to Adhesion of Bifidobacteria

ZHU De-quan1,2, LI Jin-liu1, WANG Ming-yue1, MENG Xiang-chen2*et al

(1. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

Bifidobacteria which are commensal microorganisms of the human and animal gastrointestinal tract (GIT) are being incorporated increasingly into dairy and other products, because of the health benefits(regulating intestinal flora, improving immunity, anti-inflammation and anti-tumor) provided by them. The adhesion and colonization abilities of bifidobacteria are critical prerequisites for performing their physiological functions. However, it must encounter a lot of stresses occurring during their production, package, delivery, storage and consumption (e.g. heat, oxygen, acid, bile, osmotic, etc). These stress factors will influence adhesion ability and expression of adhesive proteins bifidobacteria. The research advances of effects of environmental stress on bifidobacteria survival, adhesion ability and proteins related to adhesion were reviewed.

Bifidobacteria; Adhesion; Colonization; Adhesion related proteins; Environmental stress factors

佳木斯大學(xué)科研項(xiàng)目((S2011-049)。

朱德全(1980- )，男，貴州遵義人，講師，博士，從事微生物生物技術(shù)研究。 *通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事微生物生物技術(shù)研究。

2016-06-12

S 182

A

0517-6611(2016)21-131-03