王春玲（齊魯師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250013）

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蜂膠中蘆丁和槲皮素的含量及抗氧化性能研究

王春玲
（齊魯師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250013）

摘要：用高效液相色譜對(duì)蜂膠乙醇提取物（EEP）中的蘆丁和槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)不同處理方法得到的EEP進(jìn)行抗氧化性能研究。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素在不同試驗(yàn)樣品的含量分別為：粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，超聲波輔助乙醇提取物中的含量分別為3.134%和6.138%，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %。通過(guò)Schaal烘箱法表明蜂膠中黃酮類(lèi)化合物含量越高，抗氧化效果越好。

關(guān)鍵詞：蘆??；槲皮素；高效液相色譜；抗氧化性能

蜂膠是蜜蜂用來(lái)防護(hù)、抵御病蟲(chóng)害和病原微生物入侵巢房的御敵物質(zhì)，同時(shí)也是作為修補(bǔ)巢房和內(nèi)環(huán)境消毒殺菌的一種特殊物質(zhì)[1-2]。蜂膠的化學(xué)組成特征是含有多種類(lèi)黃酮化合物，蜂膠因此被稱(chēng)為“黃酮類(lèi)化合物的寶庫(kù)”[3]，蜂膠的大部分生理及藥理功能都與此類(lèi)物質(zhì)有密切關(guān)系[4]。

從20世紀(jì)60年代以來(lái)，人們對(duì)黃酮或酚類(lèi)化合物的抗氧化性質(zhì)，特別是其在食用油脂中的抗氧化活性做了大量研究[5－9]。Ozcan等[10]用蜂膠的甲醇提取物（濃度從0.02 %~0.08 %）加入到橄欖油中，在60℃貯存，結(jié)果表明蜂膠甲醇提取物的濃度在0.06 %和0.08 %時(shí)的抗氧化作用要好于0.01 %的BHA和BHT。

從20世紀(jì)50年代末，隨著各種色譜分離技術(shù)的迅速發(fā)展與質(zhì)譜新技術(shù)的出現(xiàn)，使蜂膠的化學(xué)成分研究迅速發(fā)展，目前世界各地蜂膠樣品中分離出來(lái)的黃酮類(lèi)化合物已有70多種。蜂膠中的黃酮類(lèi)化合物主要包括黃酮醇類(lèi)、黃酮類(lèi)和黃烷酮類(lèi)。常見(jiàn)的黃酮醇類(lèi)有高良姜素、槲皮素、蘆丁、楊梅酮、山奈酚，黃酮類(lèi)有芹菜素、白楊黃素，黃烷酮類(lèi)有生松素等[11-13]。隨著氣質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等現(xiàn)代分析新技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外科學(xué)家又鑒定出上百種蜂膠新成分[14-16]。

作者前期已對(duì)蜂膠中黃酮類(lèi)化合物的提取、純化及抗氧化性能進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，在此進(jìn)一步用高效液相色譜對(duì)不同處理方法得到的蜂膠產(chǎn)品中的蘆丁和槲皮素進(jìn)行分離鑒定，并驗(yàn)證蜂膠中黃酮類(lèi)化合物含量與抗氧化性能的相關(guān)性，以期為開(kāi)發(fā)蜂膠產(chǎn)品作為天然食品添加劑提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料

蜂膠：購(gòu)自河南福美蜂產(chǎn)品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；豬油（新鮮豬板油）：實(shí)驗(yàn)室熬制，過(guò)濾后置冰箱內(nèi)備用。

1.1.2主要試劑

乙醇，氫氧化鈉，硝酸鋁，亞硝酸鈉，異辛烷、冰醋酸，碘化鉀，硫代硫酸鈉，重鉻酸鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸，可溶性淀粉等（均為AR級(jí)）。甲醇（色譜純），重蒸水。

維生素E、茶多酚、特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）：均為食用級(jí)。

1.2主要儀器

KQ-250超聲波清洗器、RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D循環(huán)水式真空泵：河南鞏義英峪予華儀器廠；722S分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101－1干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；LC10A高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器SPD-10AV、色譜柱：Kromasil－C18柱（0.4×25 cm）：日本島津儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蜂膠原料處理

將冷凍的粗蜂膠粉碎后過(guò)20目篩后存入冰箱中備用，即為粗蜂膠樣品。

1.3.2蜂膠處理方法

將蜂膠原料按超聲波輔助法最佳提取工藝提取得蜂膠超聲波輔助法提取物試驗(yàn)樣品，再按大孔樹(shù)脂最佳純化工藝處理得本次大孔樹(shù)脂純化后試驗(yàn)樣品[17-18]。

1.3.3色譜條件

流動(dòng)相為65 %甲醇－35 %水（用磷酸調(diào)pH至3）；流速為0.7 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

蜂膠黃酮類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱(chēng)取蘆丁、槲皮素標(biāo)樣各7.0 mg于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻備用。

樣品液的制備：稱(chēng)取蜂膠樣品0.100 g（精確到0.001 g），放入50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇，在超聲波水浴中振蕩，待樣品溶解后，用甲醇定容，用0.5 μm的濾膜過(guò)濾，濾液備用。

1.3.5蜂膠黃酮類(lèi)化合物的抗氧化性能試驗(yàn)

1.3.5.1采用Schaal烘箱法

以自制豬油為底物，采用Schaal烘箱法進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.3.5.2過(guò)氧化值的測(cè)定

參照GB/T5538-2005《動(dòng)植物油脂過(guò)氧化值的測(cè)定》。

2結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)圖譜

采用高效液相色譜法對(duì)蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品以及各不同處理方法得到的蜂膠樣品掃描得到的圖譜如圖1～4所示。

圖1蘆丁和槲皮素標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard sample of rutin and quercetin

圖2粗蜂膠樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of curde propolis

圖3蜂膠超聲波法提取物的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of ultrasonic ethanol extract of propolis

圖4大孔樹(shù)脂純化后的蜂膠產(chǎn)品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of purified propolis by macroreticular resin

由圖1可以看出，所用的HPLC法可將含有蘆丁和槲皮素標(biāo)樣的混合物在15 min內(nèi)完全分離。蘆丁和槲皮素標(biāo)樣在本試驗(yàn)色譜條件下，色譜基線平直，都呈現(xiàn)單一色譜峰，且峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，雜質(zhì)也無(wú)干擾。蘆丁出峰較早，其保留時(shí)間為5.387 min，槲皮素的保留時(shí)間為9.673 min。

在黨中央遷往當(dāng)時(shí)北平的路上，毛澤東意味深長(zhǎng)地說(shuō)：這是“進(jìn)京趕考”。“我們決不當(dāng)李自成，我們都希望考個(gè)好成績(jī)！”這考官自然是以工農(nóng)為主體的人民大眾。

由圖2～4可以看出，HPLC可以快速分離蜂膠中的黃酮類(lèi)化合物。在本試驗(yàn)色譜條件下，所有的峰基本都被很好的分開(kāi)。其中粗蜂膠中分離出26種組分；超聲法蜂膠提取物中分離出27種組分；經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的蜂膠樣品中分離出23種組分。由于標(biāo)樣的的原因，只能從中鑒定出蘆丁和槲皮素。從響應(yīng)值上可以看出，蜂膠的超聲提取物中的黃酮含量要高于粗蜂膠中的黃酮含量，低于純化后的蜂膠樣品的黃酮含量。就蘆丁和槲皮素來(lái)說(shuō)，粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，經(jīng)超聲波提取后，含量分別為3.134 %和6.138 %，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣量均為10 μL，注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，每隔4 h測(cè)定一次，總共測(cè)16 h，記錄色譜。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of stability test

槲皮素平均峰面積值為195.48，RSD為0.86 %；蘆丁的平均峰面積值為167.45，RSD為0.92 %。試驗(yàn)結(jié)果表明，本品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定，其峰面積基本不變。

2.3精密度試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，每次進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積定量，分別計(jì)算蘆丁和槲皮素的R S D在1.25 %～2.79 %，表明該試驗(yàn)條件下測(cè)定各蜂膠樣品中的蘆丁和槲皮素的含量，儀器精密度良好。

2.4抗氧化試驗(yàn)

前期試驗(yàn)已研究過(guò)蜂膠提取物的抗氧化性能，在此有對(duì)純化前后的蜂膠樣品以豬油為底物進(jìn)行了抗氧化試驗(yàn)。如圖5，6所示。

由圖5可以看出4種抗氧化劑對(duì)豬油的抗氧化性能的大小依次為：TBHQ＞蜂膠＞茶多酚＞維生素E。兩種提取方法得到的蜂膠提取物抗氧化性能相當(dāng)。

由圖6可以看出，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的蜂膠的抗氧化性能要好于蜂膠粗提物，蜂膠的粗提取物在第11 d時(shí)過(guò)氧化值已達(dá)到22 meg/kg，而經(jīng)純化后的蜂膠提取物在第16天時(shí)才達(dá)到21 meg/kg，說(shuō)明蜂膠的純度越高，抗氧化效果越好。這是因?yàn)榉淠z經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附后，雜質(zhì)含量減少，蜂膠中的有效成分即黃酮類(lèi)化合物的含量提高了，單位質(zhì)量中的總黃酮類(lèi)化合物含量增加，因此抗氧化效果好。

圖5不同抗氧化劑對(duì)豬油氧化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects on oxidation stability by different antioxidant of lard

圖6純化前后的蜂膠提取物對(duì)豬油氧化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects on oxidation stability by Before and after purified of propolis

3　結(jié)論

1）HPLC法可以快速分離鑒定蜂膠中的黃酮類(lèi)化合物，在本試驗(yàn)色譜條件下，蘆丁和槲皮素在不同處理方法下的含量分別為：粗蜂膠中的含量分別是1.823 %和6.03 %，經(jīng)超聲波輔助提取后，含量分別為3.134 %和6.138 %，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后其含量分別為4.256 %和13.483 %，大孔樹(shù)脂純化效果明顯。由于標(biāo)樣的關(guān)系，只能鑒定出蜂膠樣品中的兩種組分。

2）蜂膠乙醇提取物有良好的抗氧化效果，試驗(yàn)測(cè)得4種抗氧化劑對(duì)豬油的抗氧化性能的大小依次為：TBHQ＞蜂膠乙醇提取物＞茶多酚＞VE；純化后的蜂膠提取物的抗氧化效果好于蜂膠粗提物，說(shuō)明蜂膠中黃酮

類(lèi)化合物含量越高，抗氧化效果越好。

3）我國(guó)蜂膠資源豐富，蜂膠中黃酮類(lèi)化合物含量很高，而黃酮類(lèi)化合物是食品中主要的天然抗氧化劑和添加劑。本試驗(yàn)也證實(shí)了蜂膠具有優(yōu)良的抗氧化性能，雖然將蜂膠作為天然抗氧化劑在食品工業(yè)中廣泛使用還有許多工作要做，比如固定的提取方法，急性和慢性毒理學(xué)試驗(yàn)等，但是隨著研究的深入，未來(lái)蜂膠一定會(huì)成為很有前途的天然抗氧化劑。

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Study on the Content and Antioxidant Properties of Rutin and Quercetin in Propolis

WANG Chun-ling
（School of Life Sciences，Qilu Normal University，Jinan 250013，Shandong，China）

Abstract：The content of rutin and quercetin of ethanol extract of propolis was determined by HPLC，and the antioxidant activity of ethanol extract of EEP was also researched. Analysis showed：the content of rutin and quercetin was 1.823 % and 6.03 % respectively in crude propolis；3.134 % and 6.138 % respectively in ultrasonic assisted ethanol extract of propolis；4.256 % and 13.483 % respectively in purification by macroreticular resin.It showed that the more flavonoids contents of the propolis，the better antioxidant activity by Schaal oven method.

Key words：rutin；quercetin；HPLC；antioxidant activity

收稿日期：2014-05-15

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.010

作者簡(jiǎn)介：王春玲（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。