陳西，閻希柱,*，宿麗麗

1. 集美大學(xué)，廈門 361000 2. 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361000

PFOS對多齒圍沙蠶CYPs、GST基因轉(zhuǎn)錄及酶活性的毒性效應(yīng)

陳西1,2，閻希柱1,2,*，宿麗麗1,2

1. 集美大學(xué)，廈門 361000 2. 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361000

多毛類沙蠶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于海洋環(huán)境污染的生物監(jiān)測，但其對新型持久性有機(jī)污染物全氟辛烷磺?；衔颬FOS的毒理學(xué)研究尚無報道。本研究以潮間帶優(yōu)勢種多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)為研究對象，以細(xì)胞色素P450(CYP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的基因和酶作為聯(lián)合指標(biāo)，研究了在PFOS亞致死濃度(4、8、16 mg·L-1)暴露第1、4、7、14天及凈水恢復(fù)5 d后多齒圍沙蠶CYP431A1、CYP424A1基因轉(zhuǎn)錄水平和EROD酶活性、GST omega基因轉(zhuǎn)錄水平和GST酶活性的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，PFOS暴露對EROD的抑制具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系；CYP2系成員CYP431A1基因轉(zhuǎn)錄水平對PFOS的響應(yīng)具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系并在脅迫第14天表現(xiàn)出最高的可誘導(dǎo)性；CYP4系基因CYP424A1的轉(zhuǎn)錄在4、8 mg·L-1處理組中與PFOS暴露時間正相關(guān)。II相解毒系統(tǒng)成員GST酶活和GST omega基因的響應(yīng)均表現(xiàn)出隨著PFOS脅迫時間的延長先下降，后上升的規(guī)律；多齒圍沙蠶在高強(qiáng)度PFOS脅迫下仍可加速新陳代謝，表現(xiàn)出對PFOS的耐受性；凈水恢復(fù)階段，各指標(biāo)都有向?qū)φ战M水平恢復(fù)的趨勢?？傊?，基因和蛋白的響應(yīng)表明CYPs和GST在多齒圍沙蠶PFOS新陳代謝中發(fā)揮重要作用，這些基因和酶具有作為生物標(biāo)志物監(jiān)測海洋潮間帶PFOS污染效應(yīng)的潛力。

全氟辛烷磺酸化合物(PFOS)；多齒圍沙蠶；氧化損傷；細(xì)胞色素P450；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶

全氟辛烷磺?；衔?perfluorooctane sulfonate, PFOS)是最主要的全氟化污染物[1]，已經(jīng)造成全球性污染，其環(huán)境效應(yīng)也受到越來越多的關(guān)注[2]。2009年，PFOS作為新型持久性有機(jī)污染物被正式列入《斯德哥爾摩公約》附件[3]。但是PFOS仍然被制造和應(yīng)用，而且PFOS是多種全氟化合物前體的終端產(chǎn)物，有超過50類PFOS前體廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[4]，Thibodeaux等[5]指出，人類和環(huán)境仍將長期處于PFOS的暴露中。PFOS在水體中的污染水平相對較低，處于納克級，但PFOS具有生物放大效應(yīng)，通過食物鏈蓄積于高營養(yǎng)級生物體內(nèi)，可達(dá)毫克級水平。例如，在采集自德國海灣的斑海豹組織中含有的18種全氟化合物中，PFOS污染濃度最高，達(dá)到1.7 mgg-1[6]；Tomy等[7]檢驗北極東部海域PFOS在食物網(wǎng)中的生物富集程度，PFOS在所有受檢物種中均存在并且污染含量最高，PFOS污染生物放大因子為0.4～9.0，表現(xiàn)出與物種營養(yǎng)級之間顯著的線性關(guān)系。Martin等[8]在北極生物群食物鏈頂端的北極熊體內(nèi)檢測到，最高濃度達(dá)到4 mgg-1。關(guān)于我國PFOS在生物體內(nèi)污染的研究中，比較值得關(guān)注的是PFOS在海洋食品中的污染。Gulkowska等[9]以水產(chǎn)市場為檢測對象，發(fā)現(xiàn)PFOS做為最主要的氟化污染物在27類海洋食品樣品包括軟體動物、螃蟹、小蝦、牡蠣、蚌和蛤中均被檢出，最高污染濃度達(dá)到1.3 mgg-1。張新等[10]在大連市常見海洋產(chǎn)品如魚、蟹、烏魚中也檢測到PFOS的普遍污染。此外，因為PFOS是眾多全氟化合物的終產(chǎn)物，經(jīng)污水處理廠處理后排放的水中，PFOS含量反而會升高。李飛等[11]檢測全氟有機(jī)酸在上海市9座污水處理廠進(jìn)水和出水中的污染情況，結(jié)果表明中等鏈長(C6～C10)全氟有機(jī)酸會在污水處理過程中顯著增加，其中PFOS是主要的全氟污染物之一，濃度為最高為1.027 mgL-1占總?cè)袡C(jī)酸污染物的1%～30%。PFOS因污染持續(xù)性，蓄積性和已造成全球污染的現(xiàn)狀受到廣泛關(guān)注，亟需進(jìn)一步探討PFOS致毒機(jī)理并篩選可行的生物標(biāo)志物。

沙蠶是環(huán)節(jié)動物門、多毛綱、沙蠶目、沙蠶科動物的通稱，是潮間帶生態(tài)系統(tǒng)中的主要類群，在近岸水域食物網(wǎng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮重要作用。任可欣和閻希柱[12]基于沙蠶的分布廣泛性，養(yǎng)殖易得性，以及已經(jīng)表現(xiàn)出的生境修復(fù)功能將沙蠶列為現(xiàn)階段我國灘涂修復(fù)優(yōu)勢種。目前已經(jīng)開展了多毛類沙蠶分子生物標(biāo)志物對多種重金屬污染和有機(jī)污染指示的研究。研究表明，沙蠶在養(yǎng)殖底泥[13]，蝦池水質(zhì)[14]，河口的泥水界面[15]的生境修復(fù)中發(fā)揮重要作用。尚無探討潮間帶優(yōu)勢種多齒圍沙蠶作為PFOS污染指示物種可行性的研究。

胞色素P450(cytochrome P450, CYP)屬于Ⅰ相解毒系統(tǒng)，在內(nèi)源性基質(zhì)生物轉(zhuǎn)化和催化作用中發(fā)揮重要作用，還可將脂溶性有機(jī)異生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性、易排泄的代謝產(chǎn)物，幾乎存在于生物體內(nèi)的所有組織[16]，由于CYPs可對低劑量的外源污染物產(chǎn)生響應(yīng)，這使得利用CYPs酶活性或基因表達(dá)量指示低劑量PFOS生態(tài)毒理診斷成為可能[17-18]。7-乙氧基異吩惡唑-O-脫乙基酶(EROD)的活性可以用來表示對CYP1A1亞型的誘導(dǎo)作用[19]。目前以EROD酶為代表的CYPs作為生物標(biāo)志物反映污染脅迫效應(yīng)在不同生物中得到驗證。Oost等[20]因EROD在肝臟中表現(xiàn)出的敏感性而將其列為最有價值的魚類生物標(biāo)志物。目前已經(jīng)開展EROD酶作為多種持久性有機(jī)污染物如二噁英[21]、多氯聯(lián)苯[22]、苯并(a)芘[23]等的生物標(biāo)志物的研究。但是在復(fù)雜的污染海域，如果僅僅應(yīng)用EROD活性這一個生物標(biāo)志物來監(jiān)測和評估海洋環(huán)境污染及其效應(yīng)狀況將具有一定的局限性，有可能出現(xiàn)指標(biāo)與環(huán)境污染程度不完全一致的情況[19]。CYPs蛋白與基因水平的聯(lián)合指示對野外生境污染物的監(jiān)測更具有實際意義。然而與脊椎動物不同，無脊椎動物尚未克隆得到CYP1A序列，至今只鑒定得到十幾條多毛綱動物的CYPs基因[24-25]。CYP431A1由Won等[26]克隆，屬于CYP2系成員，與脊椎動物CYP1家族屬于同一系，該研究探究了多齒圍沙蠶CYPs基因作為多環(huán)芳烴(PAHs)生物指示物的可行性，結(jié)果顯示CYP431A1 mRNA表達(dá)量與對照組相比上調(diào)800倍，并具有良好的劑量效應(yīng)。推斷多齒圍沙蠶CYP2系基因CYP431A1在代謝親水性PAHs毒性中發(fā)揮顯著作用，提供了環(huán)境監(jiān)測評估的可能性，但多齒圍沙蠶CYP431A1外源性物質(zhì)新陳代謝中各種生化功能仍不清楚，需要更多沙蠶CYP2系基因的研究。CYP424A1基因由Zheng等[27]克隆，歸類于新的CYPs家族但屬于CYP4系成員。研究發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄水平對PAHs脅迫表現(xiàn)出了最高的可誘導(dǎo)性(12倍)并指出CYP424A1可能在外源性物質(zhì)解毒過程中扮演著較為活躍的角色。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)是廣泛分布于動物、植物及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，屬于Ⅱ相解毒酶。GST能催化過氧化物的還原反應(yīng)，促進(jìn)GSH的巰基(-SH)與毒素結(jié)合形成親電子試劑[28]從而減輕污染物毒性。廈門島周圍F個采樣點僧帽牡蠣消化腺和鰓中GST的活性與整個組織石油碳?xì)浠衔锏暮坑泻芎玫南嚓P(guān)性[29]。Cairr?o等[30]的一項研究認(rèn)為用墨角藻GST活性作為環(huán)境生物標(biāo)志物進(jìn)行沿海地區(qū)和港灣污染監(jiān)測是可行的。GST基因含有多個成員，GST omega基因在多齒圍沙蠶對鎘脅迫的響應(yīng)中具有高的敏感性和劑量-效應(yīng)關(guān)系，被認(rèn)為是多齒圍沙蠶最具有潛力的分子生物標(biāo)志物之一[31]。

本文首次研究了潮間帶這一重要生態(tài)系統(tǒng)中多齒圍沙蠶CYPs及GST在PFOS脅迫下基因(CYP431A1、CYP424A1、GST omega)，酶活性(EROD、GST)的聯(lián)合響應(yīng)，以期建立量效關(guān)系，為評價PFOS污染效應(yīng)提供依據(jù)，探究二者在PFOS新陳代謝中可能的功能和解毒機(jī)理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

主要試劑包括全氟辛烷磺酸鉀(C8F17KO3S)，純度AR級(Tokyo公司)。蛋白定量試劑盒，GST酶活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，7-乙氧基異吩噁唑酮(ERF)，異吩噁唑酮(RF)均購自sigma公司。Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，回收試劑盒，實時熒光定量試劑盒均購自Takara公司。助溶劑二甲基亞砜(DMSO)及其他試劑為市售AR級分析純。使用的主要儀器包括熒光分光光度計(Cary Eclipse，美國Varian)；酶標(biāo)儀(Synergy HT，美國BioTek)；熒光定量PCR儀(Fast step one，美國ABI)。

1.2 暴露實驗

受試動物多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)購自福建省福清沙蠶養(yǎng)殖場。健康成體沙蠶在潔凈海水(鹽度30‰；溫度(22±1) °C；pH 7.8；DO (6.5±0.5) mg·L-1)中暫養(yǎng)7 d，海水取自集美大學(xué)海水養(yǎng)殖場，經(jīng)4層紗布過濾并煮沸冷卻后用于試驗，期間不斷曝氣。餌料為凡納濱對蝦餌料，顆粒粒徑粉碎為60目后投喂，每日喂食2次及時清理死亡個體。24 h饑餓處理后挑取規(guī)格一致的沙蠶(0.45 g±0.05 g)進(jìn)行暴露實驗，試驗期間停止喂食。

實驗在500 mL燒杯中進(jìn)行，鋪2 cm經(jīng)450 ℃灼燒6 h的細(xì)沙。根據(jù)前期實驗結(jié)果，以PFOS對多齒圍沙蠶96 h-LC50(64 mgL-1)的1/4，1/8，1/16為暴露濃度(DMSO助溶，終濃度0.01%)，以DMSO(終濃度0.01%)海水組和空白海水組做對照，脅迫14 d后，各處理組轉(zhuǎn)入潔凈海水中進(jìn)行凈水恢復(fù)實驗，每天換液一次并晝夜曝氣。每個處理取3個平行樣，各放入10條沙蠶，加溶液20 mL。于暴露實驗的第1、4、7、14天以及凈水恢復(fù)的第5天(圖中用r5表示)活體取樣。暴露期間，沙蠶出現(xiàn)行動遲緩等癥狀，但存活狀況良好未發(fā)現(xiàn)該脅迫強(qiáng)度下有死亡個體。

1.3 酶活性的測定

稱取沙蠶除頭部以外的組織樣品(30 mg±1.5 mg)加1.5 mL預(yù)冷的勻漿液(磷酸緩沖液，pH 7.6)，在冰浴中每勻漿15 s，暫停30 s，循環(huán)3次，立即冷凍離心(-4 ℃，10 000 r·min-1，20 min)，取上清液立即測EROD酶活和總蛋白質(zhì)含量。根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]的方法稍加改進(jìn)，測EROD酶活性。反應(yīng)溫度為室溫20 ℃，反應(yīng)總體系中含磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.6)3 mL，待測酶樣200 μL，ERF(0.40 mmol·L-1)20 μL。反應(yīng)通過加入NADPH(0.25 mmol·L-1)20 μL啟動。激發(fā)波長為532 nm，發(fā)射波長580 nm，反應(yīng)開始后每隔30 s記錄產(chǎn)物RF熒光值至5 min。繪制RF標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所測得的數(shù)據(jù)作線性回歸，求其產(chǎn)物每分鐘的變化情況，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)歸一化處理后，即可計算出其活性，酶活單位為pmol·min-1·mg prot-1。GST酶活性和總蛋白含量的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，GST酶活性數(shù)據(jù)來自實驗室未發(fā)表的成果，所有暴露實驗條件及方法與本研究一致。

1.4 基因相對表達(dá)量的測定

取沙蠶除頭部以外的組織樣品(100 mg±5 mg)于液氮中研磨，每個處理取3個平行樣，按照Trizol試劑盒說明書提取樣品總RNA，并根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳以及樣品A260/280比值判斷總RNA質(zhì)量與完整度，測定RNA濃度，以1 000 ng的總RNA為初始模板合成cDNA。

多齒圍沙蠶內(nèi)參基因18S rRNA，CYPs基因CYP431A1、CYP424A1、GST基因GST omega通過Primer primer 5.0設(shè)計并由華大基因合成，引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢驗引物是否可以單一特異性擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行梯度稀釋，作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值檢驗引物的擴(kuò)增效率。

熒光定量PCR反應(yīng)體系包括模板cDNA 1 μL，SYBR Premix EX Taq 10 μL，PCR上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX Dye 0.4 μL，雙蒸水7 μL，配制20 μL反應(yīng)體系，每個生物學(xué)平行做3個復(fù)孔。

表1 逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR中檢測CYPs和GST mRNAs的引物序列Table 1 Primer sequences for CYPs and GST mRNAs in RT-real time PCRs

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果最終確定反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，40個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行LSD多重分析，“*”、“**”表示處理組與對照組差異顯著，顯著性水平為P<0.05、P<0.01。實時熒光定量數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果(Results)

通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)助溶劑對照組與空白對照組中的多齒圍沙蠶各指標(biāo)的響應(yīng)無顯著差異，表明0.01%的DMSO對指標(biāo)的變化沒有影響。以下分析PFOS對多齒圍沙蠶CYPs、GST酶活性和基因表達(dá)的影響時選取助溶劑對照組作為參照。對各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，符合方差齊性的要求。

圖1 PFOS對多齒圍沙蠶EROD酶活性的影響注：r5表示凈水恢復(fù)實驗時間為5 d。*、**表示與二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照相比，差異顯著，P<0.05、P<0.01。下同。Fig. 1 The response of EROD activity of P. nuntia exposed to PFOSNote: r5 means the 5-day recovery period. *, ** mean the statistical difference from control (DMSO) group at P<0.05 and P<0.01 respectively. Similarly hereinafter.

2.1 PFOS對多齒圍沙蠶EROD酶活性和CYPs基因相對表達(dá)的影響

本研究測定的RF濃度與熒光強(qiáng)度F值(x)具有良好的線性關(guān)系，y=0.00094x+0.13391，R2=0.997。PFOS脅迫下多齒圍沙蠶EROD酶活性變化如圖1。與對照組相比，EROD酶活性總體處于被抑制的狀態(tài)，脅迫第1天時EROD活性被顯著抑制(P<0.01)，第4天時有所上升但仍低于對照水平。在7～14 d脅迫階段，不同處理組EROD酶活性均表現(xiàn)出線性下降趨勢，隨著脅迫時間增加PFOS對EROD酶活性的抑制程度逐步上升。脅迫過程中EROD酶活性普遍在低濃度4 mg·L-1處理組中具有更高的抑制率。凈水處理階段EROD的酶活性有所恢復(fù)，各處理組分別為脅迫第14天的1.98、2.70、1.63倍。

利用RT-real time PCRs檢測多齒圍沙蠶暴露于不同濃度PFOS在不同時間CYP431A1、CYP424A1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的變化情況(圖2)。結(jié)果顯示，CYP431A1基因的表達(dá)(圖2A)具有一定的劑量效應(yīng)，相同脅迫時間內(nèi)，基因表達(dá)量隨脅迫濃度的增加呈遞增趨勢。在脅迫初期第1天基因CYP431A1表達(dá)量顯著(P<0.01)上升且在16 mg·L-1濃度處理組表現(xiàn)更加明顯，達(dá)到對照組的12倍，在4、7 d的脅迫中，在各劑量組中該基因的表達(dá)受到了一定的抑制，但與相應(yīng)的對照組比較，高劑量處理組中該基因上調(diào)表達(dá)仍然呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.01)。脅迫第14天各處理組表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著(P<0.01)上調(diào)，3個處理組CYP431A1表達(dá)量分別達(dá)到對照組的45、51、80倍。凈水恢復(fù)5 d后基因表達(dá)量明顯下降。

圖2B中，同一濃度下隨著脅迫時間的延長，各處理組CYP424A1基因相對表達(dá)量總體上出現(xiàn)上調(diào)，呈現(xiàn)出該基因表達(dá)量隨時間的延長而升高的趨勢。其中，4 mg·L-1處理組在脅迫1～4 d與對照組無顯著差異，在脅迫第7、14天分別達(dá)到對照組的2倍、5倍；8 mg·L-1處理組在脅迫1～7 d與對照組無顯著差異，但在第14天與對照組差異顯著(P<0.01)并達(dá)到對照組的3倍；16 mg·L-1處理組基因表達(dá)量在脅迫1～7 d也出現(xiàn)線性增長，在脅迫第14天被抑制。CYP431A1基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。但PFOS脅迫與該基因表達(dá)含量之間并未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，普遍結(jié)果表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的升高基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，凈水恢復(fù)5 d后該基因表達(dá)量有所下降。

2.2 PFOS脅迫對多齒圍沙蠶GST酶活性和GST基因相對表達(dá)量的影響

根據(jù)前期實驗結(jié)果(圖3)，GST酶活性在PFOS脅迫第1天的低濃度4 mg·L-1處理組中被顯著抑制(P<0.05)，抑制率為50%；在中濃度8 mg·L-1處理組也被顯著抑制(P<0.01)，抑制率為70%；但在高濃度16 mg·L-1處理下活性有所上升。該特征也體現(xiàn)在時間-效應(yīng)中，隨著脅迫時間的延長GST酶活性被抑制，但在脅迫后期14 d時各處理組均有所上升，雖然8 mg·L-1濃度處理組GST酶活性仍低于對照，但相較于脅迫第7天上升了1.3倍，14 d時已基本回到對照水平(P>0.05)，而14 d時4、16 mg·L-1濃度處理組則顯著高于對照水平(P<0.05)。在凈水恢復(fù)后5 d，除中濃度處理組外，GST酶活性有恢復(fù)正常表達(dá)的趨勢。

除脅迫第1天，4 mg·L-1處理組以外，各脅迫情況下GST基因相對表達(dá)量(圖4)始終高于對照組，表明GST基因參與到了PFOS的外源性物質(zhì)代謝中。GST基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，總體表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的升高而升高。8 mg·L-1和16 mg·L-1處理組出現(xiàn)了相似的時間效應(yīng)關(guān)系，均在脅迫1～4 d有所上升，在脅迫第7天被抑制，在脅迫后期第14天出現(xiàn)了顯著的上升(P<0.01)；而低濃度4 mg·L-1處理下，GST基因相對表達(dá)量在1～4 d期間顯著高于對照組(P<0.05)，7～15 d期間表達(dá)量持續(xù)上調(diào)與對照組差異顯著(P<0.01)。不同處理組GST表達(dá)量均在第14天顯著上調(diào)并達(dá)到最高值，分別為對照組的6、8、7倍。凈水恢復(fù)后5 d，GST表達(dá)量有所下降，其中4、8 mg·L-1處理組下降到對照水平，16 mg·L-1處理組仍顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 PFOS對多齒圍沙蠶CYPs基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 2 The response of CYPs mRNA relative expression of P. nuntia exposed to PFOS

圖3 PFOS對多齒圍沙蠶GST酶活性的影響Fig. 3 The response of GST activity of P. nuntia exposed to PFOS

圖4 PFOS對多齒圍沙蠶GST基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 The response of GST mRNA relative expression of P. nuntia exposed to PFOS

3 討論(Discussion)

本研究中，EROD活性與對照組相比總體處于被抑制的狀態(tài)，脅迫第1天各處理組酶活性與對照組產(chǎn)生顯著差異(P<0.01)，但隨著PFOS脅迫時間的延長EROD活性反而有所恢復(fù)，第4天時已恢復(fù)到正常水平，酶活性恢復(fù)到一定程度后隨著脅迫時間的延續(xù)而降低。同一濃度組的EROD酶活性隨時間均呈現(xiàn)出先上升后下降的鐘形曲線，這種趨勢反映PFOS暴露初期可以對EROD酶活性產(chǎn)生抑制，機(jī)體可以通過恢復(fù)CYP1A1酶活性并與PFOS結(jié)合，增加外源性物質(zhì)極性。但隨著代謝產(chǎn)物的增加，仍對CYP1A1酶活性產(chǎn)生抑制，這種抑制趨勢可以在凈水恢復(fù)階段得到緩解。在PFOS對赤子愛勝蚯蚓脅迫的研究中，細(xì)胞色素450含量與其他抗氧化防御系統(tǒng)酶如過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)相比也表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性[32]。值得注意的是，在4～14 d的后期脅迫中各處理組EROD酶活性均呈下調(diào)趨勢，酶活性與脅迫時間具有良好的線性關(guān)系，R2值分別為0.85(4 mgL-1)、0.96(8 mgL-1)、0.91(16 mgL-1)。結(jié)果表明PFOS脅迫強(qiáng)度與多齒圍沙蠶EROD酶活性的抑制之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，因此，多齒圍沙蠶EROD酶活性的抑制程度有作為環(huán)境污染指標(biāo)的潛力。一些研究已經(jīng)表明PFOS暴露無法誘導(dǎo)動物CYP1A[33-34]。Hu(2003)等[34]通過測定EROD酶活性發(fā)現(xiàn)PFOS單獨(dú)脅迫無法誘導(dǎo)CYP1A1的表達(dá)。本研究EROD活性始終處于被抑制狀態(tài)與之結(jié)果相似。以EROD酶抑制率作為高強(qiáng)度脅迫下污染等級的評價指標(biāo)還需要更深入的統(tǒng)計。

CYP2系基因CYP431A1 mRNA在PFOS脅迫初期就表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)，最高濃度組(16 mgL-1)達(dá)到對照的12倍，隨著脅迫時間的延長，該基因的表達(dá)逐漸恢復(fù)初始水平，在脅迫后期第14天，最高濃度組達(dá)到對照組的80倍表現(xiàn)出顯著的可誘導(dǎo)性(P<0.01)。這表明CYP431A1可能參與機(jī)體在損傷初期的氧化應(yīng)激保護(hù)和損傷后期的外源性物質(zhì)代謝。在脊椎動物和一些昆蟲中，CYP2系(如CYP1、CYP2家族)包含大量功能的酶可在不同藥物和外源性物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[35]。本研究與Won等[26]的研究結(jié)果相似，顯著上調(diào)的CYP431A1表明多齒圍沙蠶CYP2系對PFOS所引起的損傷最為敏感。Rewitz等[36]的研究表明海濱螃蟹(Carcinus maenas)CYP2系CYP330A1基因可被苯巴比妥和苯并芘(BaP)誘導(dǎo)并指出CYP2系在無脊椎動物和脊椎動物中有相似功能的酶。Brinkworth和Hodson[37]報道了虹鱒魚CYP2系酶可能參與低分子量外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。CYP431A1與脊椎動物CYP1家族屬于同一系[26]，PFOS對真鯛CYP1A1誘導(dǎo)結(jié)果表明[38]，CYP1A1參與PFOS代謝是由多環(huán)芳烴受體AhR所介導(dǎo)的，這與大部分研究結(jié)果相似，真鯛CYP1A1基因在高濃度PFOS脅迫(2 mgL-1)和長時間(7 d )脅迫下均呈現(xiàn)被抑制的趨勢，CYP1A1在PFOS低強(qiáng)度脅迫下的表達(dá)更為活躍。PFOS對斑馬魚肝臟內(nèi)CYP1A基因的誘導(dǎo)也呈現(xiàn)隨濃度升高先上升后回落的趨勢[39]。本研究中，CYP431A1在PFOS前7 d脅迫下表達(dá)水平也表現(xiàn)為先顯著上升后下降，與魚類CYP1A參與PFOS代謝的表達(dá)趨勢部分吻合，暗示CYP431A1可能在多齒圍沙蠶外源物質(zhì)代謝中發(fā)揮著與脊椎動物CYP1A相似的作用。

與CYP431A1相比，PFOS脅迫下多齒圍沙蠶CYP4系基因CYP424A1并沒有特別突出的誘導(dǎo)量，但是該基因表達(dá)具有一定的時間效應(yīng)，隨脅迫時間延長，不同濃度組總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。哺乳動物中，CYP4酶催化脂肪酸末端羥基化并且活躍多類有毒物質(zhì)新陳代謝，昆蟲CYP4基因參與外源性物質(zhì)的新陳代謝，并且可能參與了對殺蟲劑的抵抗[27]。與Li等[24]在小頭蟲(Capitella capitata)，趙歡等[40]在雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)上的研究結(jié)果相似，CYP4在多毛綱的表達(dá)誘導(dǎo)程度較低，但鑒于CYP424A1表達(dá)的持續(xù)上調(diào)，推斷該基因在PFOS代謝中仍處于較活躍的位置。CYP424A1構(gòu)型和脊椎動物CYP3A基因非常相似[27]，CYP3A酶同樣在魚腸道外源性食物的首過代謝中扮演著重要角色[41]。多齒圍沙蠶CYP424A1表達(dá)量在PFOS脅迫后期(14 d)對低濃度脅迫更為敏感，而高濃度脅迫使其表達(dá)量下降到與對照組無顯著差異的水平。推測多齒圍沙蠶CYP4系CYP424A1基因在高強(qiáng)度脅迫下甚至?xí)霈F(xiàn)被抑制的可能，當(dāng)然這需要更寬PFOS濃度的脅迫來證實它的轉(zhuǎn)錄抑制性。結(jié)果表明多齒圍沙蠶CYP424A1更適合做為低劑量長期PFOS暴露下的參選標(biāo)記。

EROD酶活性以及CYPs基因轉(zhuǎn)錄水平對PFOS的響應(yīng)表明多齒圍沙蠶CYP1A1亞族、CYP2系以及CYP4系成員是可對外源性物質(zhì)的脅迫產(chǎn)生響應(yīng)的。這三者分屬于CYPs不同家族，響應(yīng)模式的差異可能受以下2個方面的影響：(1)與CYPs不同成員自身與基質(zhì)親和力差異有關(guān)。例如，Kurt和Kathleen[42]的研究表明CYP2系(CYP2E)和CYP3系(CYP3A4)酶分別與人類小分子親水性化合物和親脂性的化合物具有更高的親和力。(2)Skupinska等[43]指出CYPs超家族不同成員的響應(yīng)可能受不同受體通路的誘導(dǎo)。該差異也說明，以EROD作為單一指標(biāo)進(jìn)行污染物監(jiān)測的結(jié)果可能無法概括生物體受污染狀態(tài)的全貌。從EROD反映的結(jié)果來看，在本研究的濃度范圍內(nèi)PFOS脅迫下機(jī)體解毒酶處于被抑制狀態(tài)，但從CYP2系基因的高表達(dá)和CYP4系基因表達(dá)量的持續(xù)上調(diào)來看沙蠶此時仍處于積極防御狀態(tài)。結(jié)果表明沙蠶CYPs參與到了PFOS的解毒代謝中，其中CYP2系基因扮演的角色尤為活躍，與Won等結(jié)果一致[26]。

本研究以II相解毒酶的代表GST為研究對象，探究PFOS代謝過程中II相解毒酶的響應(yīng)情況。GST基因含有多個成員，多齒圍沙蠶GST omega基因在鎘、銅污染指示中均表現(xiàn)出良好的可行性[44]，是多齒圍沙蠶極具潛力的分子生物標(biāo)志物之一[31]。本研究GST酶活性總體上處于被抑制或無顯著變化水平，而GST omega基因則受到誘導(dǎo)，與對照組產(chǎn)生顯著變化(P<0.01)。但GST酶活性的抑制趨勢在脅迫第14天得到恢復(fù)，其中4、16 mg·L-1濃度組均顯著高于對照水平，而8 mg·L-1濃度處理組也從顯著抑制狀態(tài)恢復(fù)到對照水平，這種上調(diào)趨勢與基因GST omega轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)出現(xiàn)較為一致的趨勢，在脅迫后期7～14 d顯著上升。PFOS暴露后期，GST酶活性和GST omega基因的上調(diào)表明PFOS誘導(dǎo)的Ⅱ相解毒是由CYPs基因及酶進(jìn)行I相解毒反應(yīng)所誘導(dǎo)，并且在本研究的濃度范圍內(nèi)PFOS脅迫仍可以加速多齒圍沙蠶體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)形成的親電子劑的代謝解毒，清除體內(nèi)形成的氧化還原產(chǎn)物和氧自由基[45]。

PFOS作為外源性物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，多齒圍沙蠶I相解毒系統(tǒng)CYP450，II相解毒系統(tǒng)GST的酶和基因在抗氧化防御機(jī)制中扮演重要角色。雖然脊椎動物CYPs的多環(huán)芳烴受體AhR同系物在無脊椎動物如果蠅和線蟲中被鑒定，它們和脊椎動物有相似的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域，但它們?nèi)鄙俚湫偷奶囟ǜ哂H和性芳烴受體(AhRs)配體粘合物[46]。Yadetie等[47]也指出被囊類動物CYPs基因參與苯并a芘代謝是受其他核受體的誘導(dǎo)，Zheng等[48]則探究了多毛類以孕烷X受體PXR，核受體CAR為核受體的可能性。PFOS通過干擾多齒圍沙蠶CYPs通路受體對機(jī)體I相解毒反應(yīng)系統(tǒng)的觸發(fā)，以及EROD酶活及2類CYPs基因在誘導(dǎo)初期的快速應(yīng)答均反映了多齒圍沙蠶CYP450參與了PFOS初級代謝，降低PFOS的親脂性，增加水溶性。隨后受到CYPs代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)，II相解毒酶GST也參與了PFOS的代謝，催化極性基團(tuán)與之共價結(jié)合，增加代謝物疏水性以促進(jìn)PFOS的代謝。目前，仍需探索PFOS脅迫下多齒圍沙蠶的核受體。此外，CYPs單氧酶經(jīng)常催化外源性物質(zhì)分解成更多的有毒代謝物，這需要聯(lián)合其他抗氧化機(jī)制研究PFOS的致毒機(jī)理，并進(jìn)一步探究多齒圍沙蠶對PFOS的代謝機(jī)制。

綜上所述，本研究探究了多齒圍沙蠶I相，II相解毒系統(tǒng)在PFOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷中發(fā)揮的保護(hù)作用。研究結(jié)果為PFOS污染預(yù)警提供了可參考的標(biāo)志物，并且為PFOS暴露下CYPs和抗氧化酶及基因所參與的機(jī)制研究依提供了依據(jù)。

致謝：感謝國家海洋公益性行業(yè)科研專項“封閉海灣典型生境物理修復(fù)和生物修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)研究與集成示范”子課題封閉海灣灘涂多毛類修復(fù)集成技術(shù)研究與示范(201205009-4)對本研究給予的經(jīng)費(fèi)支持。

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Effects of PFOS on the Genes Transcription and Enzymes Activity of CYPs, GST in PolychaetePerinereisnuntia

Chen Xi1,2, Yan Xizhu1,2,*, Su Lili1,2

1. Jimei University, Xiamen 361021, China 2. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, P. R. China, Xiamen 361021, China

Received 13 April 2016 accepted 18 May 2016

Polychaete has been widely used to monitor the environmental pollution. Perfluorooctane sulfonate (PFOS) is an emerging persistent organic pollutant that has global distribution. However, the effect of PFOS on the dominant species of polychaete, nereis, has received little attention. To research its potential biomarkers for PFOS pollution, this paper studied the combine response of genes transcription and enzymes activity of cytochrome P450 (CYP), glutathione S-transferase (GST) in nereis, Perinereis nuntia. The sandworms were exposed to sublethal concentrations of PFOS (4, 8, 16 mg·L-1) for 1, 4, 7, 14 days and recovered for 5 days, respectively. The PFOS-induced inhibition of EROD showed a time-dependent relationship clearly. The P. nuntia CYP431A1 (CYP2 clan) mRNA was sensitively expressed to PFOS exposure with a clear dose-dependent relationship and showed the highest inducibility on day 14. The transcription levels of CYP424A1, a CYP4 clan gene, in 4 and 8 mg·L-1treatments were all positively correlated with the PFOS exposure time. As one of phase II detoxification enzymes, the GST enzyme and GST omega gene both decreased first and upregulated then with the extension of PFOS exposure. P. nuntia could still accelerate metabolism under the serious exposure and showed its tolerance for PFOS. During recovery period, all the observed indexes showed a tendency to recover to the control level. In conclusion, the response of gene transcription and enzyme activity showed that CYPs and GST of P. nuntia played important roles in the PFOS detoxification and these indexes of P. nuntia would have great potentials as biomarkers to detect the PFOS pollution in marine intertidal zone.

PFOS; Perinereis nuntia; oxidative stress; cytochrome P450; glutathione S-transferase

海洋公益性行業(yè)科研專項(201205009-4)

陳西(1991-)，女，碩士，研究方向為水域生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: 1361158525@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xzyan@jmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160413001

2016-04-13 錄用日期：2016-05-18

1673-5897(2016)6-102-10

X171.5

A

閻希柱(1965-)，男，博士，教授，主要研究方向水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)。

陳西, 閻希柱, 宿麗麗. PFOS對多齒圍沙蠶CYPs、GST基因轉(zhuǎn)錄及酶活性的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(6): 102-111

Chen X, Yan X Z, Su L L. Effects of PFOS on the genes transcription and enzymes activity of CYPs, GST in polychaete Perinereis nuntia [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 102-111 (in Chinese)